蛋白质定量的新技术新方法研究

张玉奎

中国科学院分离分析化学重点实验室，国家色谱研究分析中心，大连化学物理研究所，中国，大连，116023

对特定生物样本所有蛋白质在不同状态下表达和翻译后修饰的动态变化进行规模化定量分析，对于发现重要生物功能的蛋白质、筛选疾病相关的生物标志物以及寻找药物的靶标等具有重大意义。然而细胞内蛋白质表达拷贝数不仅动态范围宽，而且蛋白质的表达量受基因组遗传信息和表观遗传信息的精确调控，随时间和空间不断变化，因此对蛋白质定量技术提出了极大的挑战。现有的蛋白质组定量技术在精确度、准确度、覆盖率和分析通量等方面存在的不足，不能满足蛋白质组定量分析的需求，因此发展具有自主知识产权或原始创新性的规模化蛋白质定量新方法及相关技术，使我国在蛋白质科学研究的国际竞争中处于前沿和领先位置具有非常重要的意义。

近年来，基于色谱分离和质谱鉴定的蛋白质组定量新技术受到了人们的广泛关注。在高效低残留的蛋白质样品处理和分离新材料方面：针对磷酸化蛋白质组定量，以结晶介孔TiO2为壳层的磁性纳米材料用于翻译后修饰蛋白质/多肽的高选择性富集，对磷酸化肽富集容量可以达到225mg/g，富集回收率高达93%；研制了纳米金掺杂亲水性聚合物整体材料，并用于人血清样品中糖肽的富集，其富集选择性达到75%，回收率达到85%。通过“一锅法”制备了反相及两亲性的有机-硅胶杂化整体柱，最高柱效可达到119,000理论塔板数/米，峰容量达到144。

在基于色谱-质谱的蛋白质组相对定量新技术和新方法方面：发展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量新方法；该方法不仅是基于常规的胰蛋白酶酶解，而且适用于所有蛋白样品分析。发展了基于位点选择性标记技术的等重标记二级质谱定量新方法；标记效率和选择性可以达到99%，相对定量RSD小于20%。发展了iTRAQ 结合18O标记的相对定量技术；可实现糖肽的定量、多组样品的同时定量，以及糖基化程度和蛋白水平的同时定量。

在基于色谱-质谱的蛋白质组绝对定量新方法和新技术方面：建立了QconCAT重组蛋白质结合18O同位素标记蛋白质的绝对定量方法，其准确度为98.6%。建立了基于标准氨基酸、稳定同位素标记的氨基酸同位素稀释法结合选择性反应检测质谱的含量测定方法。利用磁性纳米颗粒固定化酶反应器进行18O标记并成功应用于腾冲嗜热菌全蛋白复杂体系中烯醇化酶目标蛋白质的绝对定量，其误差小于10%。建了基于多反应检测（MRM）质谱技术高通量蛋白质确认策略，对多个蛋白同时进行绝对含量的测定。建立了基于MRM技术的蛋白质核心岩藻糖基化水平相对定量的策略，结合18O稳定同位素标记技术，对健康血清和肝癌血清中6个生物标志物候选蛋白质7个核心岩藻糖基化位点的修饰变化水平进行相对定量检测。建立了在金属元素标记的多重相对定量及绝对定量方法，对腾冲嗜热菌复杂样品进行定量，绝对定量误差接近10 %。

在集成化蛋白质组定量分析系统方面：设计了一种可实现蛋白质在线变性、还原、溶剂置换和酶解的集成化蛋白质样品预处理装置；溶剂置换效率可达99%，样品处理时间不超过4 min。发展了多种集成化在线固相标记系统以及多种集成化的蛋白质组学定性和定量分析系统，在线固相标记效率可达到95%，标记时间小于2.5 min，定量准确性可达到99%；

此外，将上述集成化蛋白质组分析系统和关键部件成功应用于细胞、组织和血清等实际样品的相对和绝对定量，不仅显著提高了蛋白质组定量的准确度、精密度和分析通量，而且发现了未见报道的疾病相关蛋白质，有望为蛋白质科学研究提供技术支撑。