制备超临界流体色谱法拆分拉呋替丁对映体
李永茂, 陈世谦, 顾凯, 赵宁
（上海药明康德新药开发有限公司，上海外高桥保税区富特中路288号1号楼， 200131）

摘要 目的：制备一定量的拉呋替丁光学纯对映体。方法：手性固定相填充柱超临界流体色谱法。固定相为Chiralpak AD手性固定相，流动相为甲醇(0.05%二乙胺)-CO2 （60׃40，v/v）。结果：运用该方法可以快速得到各500毫克纯度99%(e.e.)以上的拉呋替丁对映体。结论：与手性固定相常规HPLC法相比，该方法具有效率高，节省大量溶剂等优点。对手性分离来说，SFC是一个有力的工具。
关键词 拉呋替丁 制备超临界流体色谱法 对映体拆分

Enantiomer Separation of Lafutidine by
Preparative Supercritical Fluid Chromatography (SFC)
Yongmao Li, Shiqian Chen, Kai Gu, Ning Zhao
(WuXi PharmaTech Co., Ltd, No.1 Building, 288 FuTe Zhonglu,
Waigaoqiao Free Trade Zone, Shanghai, P.R.China)

Abstract Objectives: To isolate and purify optically pure enantiomers of lafutidine. Methods: Using preparative Supercritical Fluid Chromatography (SFC) with a packed Chiral Stationary Phase (CSP) column. CSP: Chiralpak AD, Mobile Phase: methanol (0.05% diethylamine) and CO2 (60:40, v/v). Results: 500 mg of each enantiomer of lafutidine was purified quickly with the chiral purity of > 99% (e.e.) using the SFC method. Conclusions: Comparing to the traditional preparative chiral HPLC, the SFC method is more efficient and saves large amount of eluting solvents. SFC is a powerful tool for chiral separations.
Key words: Lafutidine, Preparative Supercritical Fluid Chromatography (SFC), Enantiomer Separation

    拉呋替丁是新一代长效、强效H2-受体拮抗剂[1]，于2000年4月在日本上市，由于其结构中存在亚砜的棱锥结构，产生了一对手性对映异构体，国外上市的为消旋体。为了考查拉呋替丁的两种手性异构体药效之间的区别，我们尝试采用手性制备色谱技术进行分离。拉呋替丁的分子结构中含有吡啶、哌啶等多个极性基团，化合物的极性很大，在HPLC手性分析方法研究中我们发现要用到比例很高的极性流动相，且峰型较差；虽然在分析HPLC上能得到合适的分离度，但当我们在制备HPLC上放大时却因为色谱峰拖尾造成谱带严重交叉，基本上得不到ee值99%以上的单体。当我们转到超临界流体色谱上做方法研究时情况有了较大的改善，无论在分析还是在制备上手性异构体都在很短的时间内得到了良好的分离。经查阅国内外文献，未发现相关报道。超临界流体色谱作为一种快速高效的分离技术正得到越来越广泛的应用。
1实验部分
1.1仪器与试药
1.1.1仪器 分析型SFC色谱仪，MultigramII制备型SFC色谱仪(Berger Mettler Toledo，USA)；Pre-Star制备型HPLC, Rampak装柱机(Varian，USA)；LC-20A 型HPLC(Shimadzu，Japan )
1.1.2试药 拉呋替丁原料药(纯度99%)；液体CO2(99.999%，上海成功气体公司)、甲醇，乙醇，正己烷，二乙胺 (HPLC级，Merck)
1.2实验方法与结果
1.2.1拉呋替丁手性分析方法试验
供分析用溶液的配制：称取原料药溶于甲醇制成每1ml含拉呋替丁1mg的溶液，过0.45μm滤膜，备用。
分析方法选择：流动相组成为A相(MeOH(0.05%二乙胺)，作改性剂)，B相(超临界CO2)，A׃B 50׃50，2ml/min；柱温35℃；出口压力100bar。在上述色谱条件下，吸取供分析用溶液10μl分别在Chiralpak AD-H，Chiralpak AS-H， Chiralcel OD-H，Chiralcel OJ-H(规格均为：粒径5μm；250mm×4.6mm，L×ID)四种手性色谱柱上进行分析方法初选。根据初选的结果，调整MeOH和CO2的比例，使得两个对映体的保留时间在适合的范围内，分析两个对映体在不同色谱柱上的容量因子(k1,k2)以及分离度(RS)，结果见表1。

      由上表可见，调整流动相使得容量因子在3左右，拉呋替丁在AD-H ，AS-H ，OJ-H三种手性柱上均达到基线分离，而在OD-H上没有分离度。其中Chiralpak AD-H柱分离度最好(图1)，故选用其作为制备型SFC的固定相。分析色谱条件确定为：色谱柱Chiralpak AD-H ；流动相为MeOH(0.05%DEA)-CO2 （60׃40，v/v），2ml/min；柱温35℃；出口压力100bar。
1.2.2拉呋替丁手性制备拆分试验
供制备用溶液的配置：称取原料药溶于甲醇制成每1ml含拉呋替丁50mg的溶液，过0.45μm滤膜，备用。
样品的制备型分离条件试验：流动相为MeOH(0.05%DEA)-CO2 （60׃40，v/v）60ml/min；柱温35℃；出口压力100bar；色谱柱为Chiralpak AD(粒径20μm；400mm×25mm L×ID)。在上述色谱条件下，吸取供制备用溶液进样分析，在确保纯度的前提下逐渐增加进样量。最终确定进样量为1.2ml，即每次进样拉呋替丁60mg。
样品的回收率试验：在上述色谱条件下，吸取供制备用溶液，连续进样2组，每组进样10次(见图2)，每次1.2ml，进样间隔 6.5min，按时间收集组分，低温旋转蒸发挥干溶剂，直至重量不再减轻，精密称重，计算回收率。
共得到3份组分，分别为对映体1、交叉、对映体2。按1.2.1项下选定的色谱条件测定对映体过量(e.e.)值(图1)，并称重计算回收率，具体结果见表2。

2讨论
2.1 超临界流体色谱法(SFC)是一种利用超临界状态的气体(常用CO2)作为流动相的色谱技术，已经被成功的应用于分析和制备级的分离。与HPLC 相比，其流动相的粘度低，样品的传质效率高；对于相同的色谱柱，可以使用更大的流速，组分有更好的分辨率，提高了效率；使用CO2做流动相，减少了有机溶剂的使用量[2]。应用于手性对映体的分析和制备分离，除具有以上优点外，还对一些化合物有特殊的选择性[3]。
2.2 拉呋替丁结构中含有吡啶和哌啶基团，整体显碱性，因此选用加入0.05％二乙胺的甲醇作为改性剂。
2.3 我们用同一种手性固定相(Chiralpak AD, 20μm)，采用常规HPLC对拉呋替丁做了分析和制备分离(见图3)。并与SFC做了对比，色谱条件的比较见表3。

对分离的结果也作了比较，见表4

注：回收率为样品经一次分离，对色谱峰切割收集，所得的e.e.(%)符合要求的组分与其理论含量的比值。
由以上结果可见，采用SFC技术分离拉呋替丁对映体，利用1/6量的手性固定相即可达到与HPLC相近的样品处理速度，且回收率高于HPLC；分离同样质量的样品所需的有机溶剂量仅为HPLC的1/6。与HPLC相比，SFC具有效率高、成本低等优点。
参考文献
[1] 陈伟强,许德义 新型消化性溃疡治疗药拉呋替丁 J.中国新药与临床杂志,2003,22:247
[2] Berger T. A., Wilson W. H. Separation of drugs by packed-column SFC, J.Pharm.Sci., 1994, 83:281～286
[3] Karen L. Williams, Lane C. Sander Enantiomer separations on chiral stationary phases in supercritical fluid chromatography J.Chromatogr.A, 1997, 785:149
附图