PF-2D蛋白质组初步定量方法结合cICAT-LC-MALDI-TOF-TOF精确定量方法的研究
张养军 孟庆芳 钱小红
军事医学科学院二所，北京蛋白质组研究中心
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    定量蛋白质组学研究中常采用的研究策略既有在蛋白质水平上进行的定量比较（如基于2DE和DIGE的方法），也有肽段水平进行的定量方法（如以稳定同位素代谢标记为代表的生物标记和以同位素亲和标签（isotope coded affinity tages,ICAT）为代表的化学标记）。尽管不同相对定量方法各有优缺点，但相比之下，ICAT方法能够兼容分析不同条件下获得的体液、细胞和组织中绝大部分蛋白质，所以应用更加广泛；另外，由于ICAT试剂仅标记含半胱氨酸残基的肽段，因此通过亲和提取，可以大大降低了蛋白质混合物的复杂性，并能很好地定量分析微量蛋白质。ICAT的基本原理即是把两种化学性质相同而质量不同的试剂（通常是含轻和重同位素标签的两种试剂）标记在不同来源的蛋白上，通过比较这两种同位素标签在质谱信号强度上的差异而得到不同来源的蛋白质的质量差异。自1999年Gigy等[1]人提出ICAT方法以来，通过不断研究发现被标记了同位素氕和氘的肽段在反相色谱的保留行为有差异，会影响后续的质谱定量的准确度。之后将氢同位素置换为碳同位素开发了新一代的cICAT试剂，解决了上述问题。新一代cICAT试剂包括三个基团：第一个是与半胱氨酸反应的基团；第二个是含9个同位素C13或C12标签的连接臂，标记了C13标签的是重链试剂，C12标签是轻链试剂，由此被标记肽段在质谱可有9个或9的倍数的质量数的差异；第三个基团是生物素，用来纯化标记的肽段以简化体系复杂程度，在完成纯化功能后可切掉，不影响后续的质谱分析。目前该方法主要通过与液相色谱-电喷雾离子化源（ESI源）质谱联用进行蛋白质组相对定量分析[2、3、4]，缺点是灵敏度低，要求质谱具有高的扫描速率。为了充分利用MALDI源质谱高灵敏度和重复分析的优点，并克服生物样本复杂及定量工作量巨大的不足，本研究拟采用PF-2D首先对不同来源或状态的生物样本进行色谱聚焦分离，然后对收集的馏分进行反相色谱分离，并通过对第二维的反相色谱图进行比较分析，确定差异较大的馏分进行进一步的cICAT标记、处理、毛细管液相色谱(cLC)分离、点靶和MALDI源质谱分析，希望通过这一策略的建立能与前述各种蛋白质组相对定量方法互相补充。本研究首先采用标准蛋白BSA建立了蛋白还原、ICAT试剂标记、溶液酶解、阳离子交换色谱分离、生物素抗体亲和色谱分离、生物素部分的切除、纳升级毛细管液相色谱反相分离、自动化点靶、MALDI-TOF-TOF质谱分析和结果依赖的二级质谱数据采集和数据库检索的实验路线，并考察了此条路线准确度、重现性，以及液相色谱与MALDI源质谱连用时存在的同一肽段在不同点间的重现性、同一个点上不同肽段间重现性、同一蛋白不同肽段间重现性等问题。BSA的三次实验结果准确度尚好，与理论值误差分别为：12.6%,7.9%,3%，均在本实验允许误差30%以内，相对标准偏差为25.5%，同一肽段在不同点间最大的相对标准偏差为30.6%，同一个点上不同肽段间最大的相对标准偏差为31.99%，同一蛋白不同肽段间最大的相对标准偏差为29.99%，这些实验结果显示液相色谱与MALDI源质谱连用时存在的重现性问题，以相对标准偏差来衡量基本在30%左右，提示我们在做是否存在差异时的判据至少要在50%以上，否则会出现假阳性结果。另外，通过对五种不同比例标准蛋白质的动态范围的考察，差异动态范围1:30以内时，蛋白的定量误差很小，可以准确定量；随差异动态范围的增大，蛋白的定量误差迅速上升，说明方法的准确定量范围应在1:30以内。尽管大于此范围时，实验误差较大，不影响差异蛋白质的正确判断，该方法仍可使用，但提示我们应在蛋白质水平上进行预分离，减小MALDI 源质谱分析时的信号抑制影响。采用PF-2D策略不仅解决了生物样品复杂性的问题，而且可以进行初步定量，可以减少精确定量的工作量和实验消耗。通过这一实验方案的实施，已经获得了初步结果，表明我们实验设计合理有效，为复杂生物体系中蛋白质组相对定量提供了一种新的方法选择。
参考文献
1．Steven P.Gygi, Beate Rist, ScottA.Gerber,etc Nature biotechnology 17 1999 994-999
2．David K.Han, Jimmy Eng, Huilin Zhou,etc Nature biotechnology 19 2001 946-951
3．Steven P.Gygi, Beate Rist, Timothy J.Giffin etc Jounal of Proteome Research 1 2002 47-54
4．Eugene C.Yi, Xiao-jun Li, Kelly Cooke,etc Proteomics 5 2005 1-8