不同来源黄芩药材HPLC指纹图谱的探讨
郭宗珍 王英锋 刘锁兰 刘海萍
(首都师范大学,分析测试中心,北京100037)

摘要:采用HPLC法,以Alltima C18 5μ(250mm×4.6mm)为色谱柱,乙腈(A)-0.25%磷酸(B)-四氢呋喃(C)为流动相进行梯度洗脱:0～10min(19%A-80%B-1%C)，11min(27%A-72%B-1%C)，11～26min(27%A-72%B-1%C),27min(37%A-62%B-1%C),27～60min(37%A-62%B-1%C);流速:1ml/min;检测波长:274nm;柱温:30℃;进样量:5μl.建立了不同来源黄芩药材的指纹图谱,确定了10个共有峰,并对其进行了相似度比较.该方法能快速区分不同来源黄芩药材,为黄芩药材的质量控制提供有用信息.
关键词:黄芩 HPLC 指纹图谱 相似度

    黄芩来源于唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根,性寒味苦,具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等作用.关于黄芩药材的指纹图谱已有文献报道[1,2,3],本实验在参考前人工作的基础上,考察了不同色谱柱、不同流速、不同柱温对黄芩药材指纹图谱的影响, 此三项色谱条件的探讨未见文献报道.建立了不同来源黄芩药材的指纹图谱,并进行相似度分析,为黄芩药材的鉴别提供依据.

1仪器、试剂与药材
1.1仪器
    Waters 600 controller,Waters 717plus Autosampler,Waters 2996 photodiode Array Detector,Waters In-line Degasser AF;Empower色谱数据工作站;KQ-250E型医用超声波清洗器(40KHz,250W);sartorius电子分析天平.
1.2试剂
    黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所提供),批号:110715-200514;乙腈为色谱纯(美国迪马公司),水为超纯水(18.2MΩ),其他试剂均为分析纯.
1.3药材
药材来源如表1

2方法与结果
2.1色谱条件
    色谱柱为Alltima C18 5μ(250mm×4.6mm);乙腈(A)-0.25%磷酸(B)-四氢呋喃(C)为流动相进行梯度洗脱:0～10min(19%A-80%B-1%C),11min(27%A-72%B-1%C),11～26min(27%A-72%B-1%C), 27min(37%A-62%B-1%C),27～60min(37%A-62%B-1%C);流速:1ml/min;检测波长:274nm;柱温:30℃;进样量:5μl.
2.2对照品溶液
    精密称取黄芩苷对照品2.21mg,加无水甲醇溶解并定容,作为对照品溶液(44.2μg/ml).
2.3样品溶液
    取黄芩药材粉末(过60目筛)0.2g,精密称定,置100ml容量瓶中,加无水甲醇至刻度,称定质量,超声提取45min,取出,放冷,补足质量,摇匀滤过,取续滤液3ml于10ml容量瓶中,稀释至刻度,摇匀,即得样品溶液.
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验
    取黄芩药材粉末,精密称定,按样品溶液制备方法制备,连续进样6次,结果各主要色谱的相对保留时间和其相对峰面积的RSD分别为0.02%～0.04%和0.40%～1.96%,符合指纹图谱要求,精密度良好.
2.4.2稳定性试验
    取黄芩药材粉末,精密称定,按样品溶液制备方法制备,分别于0、2、4、8、16、24h检测指纹图谱,结果各主要色普谱的相对保留时间和其相对峰面积的RSD分别为1.0%～1.79%和1.35%～1.94%,符合指纹图谱要求,稳定性良好.
2.4.3重现性试验
    取黄芩药材粉末5份,精密称定,分别按样品溶液制备方法制备、进样,结果各主要色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积的RSD分别为0.76%～1.52%和0.97%～1.25%,符合指纹图谱要求,重现性良好.
2.5不同来源黄芩药材指纹图谱的比较
    取不同来源黄芩药材粉末,精密称定,分别按样品溶液制备方法制备、进样，结果见图1,其中4号峰为内参比峰(黄芩苷峰),用相似度软件分析得到10个共有峰,各共有峰的相对保留时间和相对峰面积值如表2,3所示. 从表中可以看出,不同来源黄芩药材的各共有峰的相对保留时间RSD<2%,重现性好,而各共有峰的相对峰面积值差别较大,可用来鉴别和区分不同来源的黄芩药材.

2.6相似度分析
    运用由国家药典委员会制定的重要色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版计算软件分析,将全谱导入后,经谱图处理,随机设定北京同仁堂药店的药材图谱为参照谱(中位数),多点校正将谱峰自动匹配后与生成的对照峰进行比较,得到的相似度结果如表4.从表中可以看出河北家种的黄芩药材与北京同仁堂药店的药材差别最大,相似度为0.942;10个样品间相关性好,也但也有区别.

3讨论
3.1本实验考察了不同色谱柱(如图2),不同流速(如图3),不同柱温(如图4)对色谱图的影响. Apollo C18 5μ(150mm4×4.6mm)柱与Discovery C18 HPLC Column(25cm×4.6mm,5μm)洗脱时间(<45min)较短,但25min左右的主要色谱峰未分开;1.5ml/min的流速分离效果差;25℃与35℃时25min左右的主要色谱峰未分开,所以选择Alltima C18 5μ(250mm×4.6mm)柱,流速1.0ml/min,柱温30℃.该条件下图谱的分离度好,洗脱时间为1h.建议在建立指纹图谱的过程中,除侧重于考察提取方法,流动相系统,检测波长外考虑考察色谱柱、流速、柱温对图谱的影响.

3.2本实验考察了不同提取溶剂(甲醇、乙醇、80%甲醇、75%乙醇、甲醇+氯仿=1:1的混合溶剂)的超声提取效果,甲醇、80%甲醇、75%乙醇的提取率相差不大,但甲醇对图谱中极性较小的峰的提取较完全,故选择甲醇为提取溶剂,然后分别考察了水浴回流(1.5h),索氏提取(1.5h),超声提取(1h)三种提取方式,选择超声提取,最后考察了以甲醇为提取溶剂不同提取时间(15、30、45、60min)的提取效果,结果表明,以甲醇为提取溶剂,超声提取45min,提取较完全,方法简单,稳定性、重现性较好.
3.3参考文献选择流动相的过程中试验了以乙睛-水、乙腈-0.25%磷酸、乙腈-0.25%磷酸-四氢呋喃的2.1中所述比例的梯度洗脱,结果乙腈-0.25%磷酸-四氢呋喃的梯度洗脱效果最佳,四氢呋喃的作用明显,加后峰形尖锐,基线平稳,利于指纹图谱分析.与文献[1]比较，本文梯度少，洗脱时间短。
3.4比较十产地的图谱发现:1(山东小黄芩)、2(甘肃)、5(陕西大黄芩)、6(河北)、7(陕西两年生)号样品的图谱极其相似;8号(河北家种)样品的第9个共有峰的信号强度明显比其他样品的小,第9个共有峰前的2个分离度好的小峰也弱,而其他样品的均达到共有峰强度;9号(北京同仁堂药店)样品的第5个共有峰后的分离度好的小峰未达到共有峰强度.

参考文献
1肖蓉,袁志芳,王春英等.不同产地黄芩药材HPLC指纹图谱的研究[J].中草药,2005,36(5):743~747
2肖丽和,王红燕,李发美等.不同来源黄芩药材HPLC指纹图谱比较[J].沈阳药科大学学报,2004,21(1):28~31
3马翠英,戴宝成,林瑞超.黄芩中4种黄酮的HPLC定量分析及其黄酮类成分指纹图谱的研究[J].药物分析杂志,2003,23(2):83~86