HPLC-ELSD 在1-脱氧野尻霉素，葡萄糖和葡萄糖胺的杂质分析中的应用
刘振，尹国寅，龚佑翔*，赵宁
（上海药明康德新药开发有限公司，上海，200131）

摘要：本文建立了一种可用于1-脱氧野尻霉素，葡萄糖和葡萄糖胺的杂质分析的高效液相分析方法。该方法以乙腈/水酸性系统为流动相体系，色谱柱采用Waters Atlantis HILIC Silica (5μm, 150×4.6mm)，以蒸发光散射检测器(ELSD)进行检测，采用主成分自身对照法用于杂质含量的计算。方法验证结果表明，1-脱氧野尻霉素，葡萄糖和葡萄糖胺在0.008~0.04mg/ml范围内峰面积对浓度呈现良好的线性，线性回归系数分别为0.9993，0.9998，0.9996。1-脱氧野尻霉素，葡萄糖和葡萄糖胺的最低检测浓度分别为0.0045，0.0040，0.0039mg/ml。三种化合物在0.02mg/ml, 0.04mg/ml, 0.08mg/ml三个浓度点的重现性良好，RSD%均小于10%. 验证表明该HPLC-ELSD方法可以用于1-脱氧野尻霉素、葡萄糖和葡萄糖胺的杂质分析测定。
关键词：1-脱氧野尻霉素；葡萄糖；葡萄糖胺；高效液相色谱法；蒸发光散射检测；杂质分析
    1-脱氧野尻霉素作为α—葡萄糖苷酶的抑制剂，具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤转移等作用[1]。葡萄糖胺是一种身体自然产生的润滑剂，是形成软骨细胞的重要营养之一，主要用于治疗骨关节炎[2]。而葡萄糖则是生物体内的主要能源，在药用方面多被用于制成注射液用于补充营养或调节等渗。这三种化合物在药用方面均有一定应用价值，因而需要有合适的质量控制方法。
    1-脱氧野尻霉素、葡萄糖和葡萄糖胺均属于小分子多羟基化合物，该类型的化合物一般极性大，基本没有紫外吸收或者仅有微弱的末端吸收，难以用紫外检测器进行检测。针对此种类型的化合物的含量测定文献报道一般采用衍生化后检测[3]或者采用通用性检测器如蒸发光散射[4]、示差折光[5]进行检测，亦有文献报道采用紫外末端吸收检测葡萄糖胺[6]，而杂质分析方法却未见报道。
    本研究建立了一种高效液相分析方法可用于1-脱氧野尻霉素，葡萄糖和葡萄糖胺的杂质分析。
1 实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1 仪器 岛津LC-10A HPLC系统（包括SCL-10A系统控制器，LC-10AD泵，PGU-14A脱气系统，SIL-10AD自动进样系统，CTD-10AS柱温箱，SEDEX 75 ELSD检测器）；Water Atlantis HILIC Silica色谱柱（150mm×4.6mm, 5 μm）
1.1.2 试剂 乙腈（Merck, 4L）；三氟醋酸（TFA, TEDIA, 500ml）；葡萄糖、1-脱氧野尻霉素与葡萄糖胺均为实验室自制；实验用水为Millipore超纯水。
1.2 液相色谱条件
流动相：乙腈(0.1%TFA, w/w)-水(0.1%TFA, w/w)=95：5；流速：1.0ml/min；ELSD检测温度：40℃，雾化气：氮气，压力：3.0 bar，Gain值：10；进样量5 μl。
1.3 样品制备和分析
    分别称取1-脱氧野尻霉素，葡萄糖和葡萄糖胺各适量，加乙腈-水(80:20)溶解分别配制成约2mg/ml的待测溶液，将各待测溶液以乙腈-水(80:20)稀释100倍得1%对照溶液，将1%对照溶液和待测溶液依次进样5μl分析。
计算待测溶液测得杂质峰面积之和(Aimp)，按下式计算杂质含量：

1.4 方法验证
1.4.1 标准曲线
    分别称取1-脱氧野尻霉素，葡萄糖和葡萄糖胺各适量，加乙腈-水(80:20)溶解分别配制成约4 mg/ml的溶液作为对照储备液。
    各移取上述三种对照储备液5ml置于50ml容量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度即得混合对照母液，将此混合母液依次稀释5、10、20、50倍分别得4%、2%、1%、0.4%混合对照溶液，依次进样5μl分析。
1.4.2 重现性
    取1.4.1中的4%、2%、1%对照溶液，各进样6次，计算RSD%。
1.4.3检测限
    将对照溶液稀释后进样，以S/N=3确定检测限(S为待测化合物的响应信号，N为基线噪音)。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件选择
2.1.1 色谱柱和流动相选择
    三种化合物由于含有较多羟基，极性较大，易溶于水及甲醇等极性较大的溶剂，在一般反相HPLC系统中难以保留，而正相HPLC系统则会由于采用低极性溶剂作为流动相存在溶解性方面的问题。经过研究我们选用HILIC Silica色谱柱，以乙腈/水酸性系统对色谱条件进行了优化，结果表明1-脱氧野尻霉素、葡萄糖胺和葡萄糖在建立的方法中峰形良好且达到完全分离。
2.1.2 ELSD 检测条件选择
    由于本法采用高比例乙腈作为流动相，溶剂较易挥发，故设定加热管温度为40oC，氮气压力为3.0bar。ELSD检测器的Gain值设定对检测响应有较大影响，本研究对不同的Gain值条件下三种化合物的信噪比进行比较(见图1)。 结果表明同一浓度下三种化合物在Gain值为10时可以得到最高的信噪比，为获得相对较高的灵敏度，故将此参数设定为10。

（Glu：葡萄糖, DNJ：1-脱氧野尻霉素, Glu-amine：葡萄糖胺）
2.2方法验证
2.2.1 专属性
    1-脱氧野尻霉素，葡萄糖和葡萄糖胺三种化合物在该色谱条件下可以达到分离，色谱图见图2。

2.2.2标准曲线
    分别采用不同数据处理方式对测定结果进行分析（见表1）。结果表明三种化合物以峰面积对浓度(A-C)在0.008-0.04范围内可以获得良好的线性（0.9993~0.9998），而在0.008-0.08范围内则线性稍差(0.9946-0.9977)；以lgA-1/C进行线性回归难以获得良好的线性；而以lgA-lgC进行线性回归则可以获得比A-C更好的结果。
    由于A-C直接线性回归在实际应用中更为方便，而且在较窄范围内也能获得良好的线性，故本法采用1%自身对照法用于杂质分析。

2.2.3 重现性
    以连续6次进样峰面积计算RSD%，三种化合物不同浓度RSD%均小于10%，结果见表2。

2.2.4检测限
    实验证明，1-脱氧野尻霉素，葡萄糖和葡萄糖胺检测限分别为19.6ng、20.0ng、22.6ng，即约相当于样品杂质分析进样量的0.2%。
2.3 样品测定
    取三种化合物各适量，按样品制备方法配制溶液，进样分析，结果见图3~图5。以主成分自身对照法计算杂质含量，结果见表3。

2.4 与衍生化方法的比较
    本研究曾尝试使用衍生化法进行杂质分析，分别选用氯甲酸芴甲酯和异氰酸苯酯与1-脱氧野尻霉素进行衍生化反应，结果表明由于这两种衍生化试剂与氨基发生反应速度较快，但随着反应时间的延长，会继续与化合物中含的羟基反应，导致副产物的产生，反应进程难以把握。而如果要将化合物中含有的所有基团（羟基和氨基）完全反应，则需要相当长的反应时间和较为苛刻的反应条件。另外加入的大量衍生化试剂对样品检测会有较为复杂的空白干扰。
    故本法最终采用蒸发光散射检测器(ELSD)进行检测，该方法以乙腈/水酸性系统为流动相体系，色谱柱采用Waters Atlantis HILIC Silica (5μm, 150×4.6mm)。由于ELSD并非线性响应的检测器，因而难以在较宽范围内得到良好的线性，本文采用主成分自身对照法用于杂质含量的计算。
3 结论
    本文通过对1-脱氧野尻霉素、葡萄糖胺和葡萄糖三种化合物的检测对建立的HPLC-ELSD方法的灵敏度、重现性以及线性范围进行了系统的考察。结果表明本方法精确、快捷简便，可直接用于1-脱氧野尻霉素、葡萄糖胺和葡萄糖的杂质分析测定。1-脱氧野尻霉素、葡萄糖胺和葡萄糖代表了一类多羟基小分子化合物，本方法应可以用于其他具有类似结构的化合物的分析测定，为该类型化合物的质量控制方法提供依据。
[参考文献]
[1] Yong-Mu Kim, Myeong-Hyeon Wang & Hae-Ik Rhee. Carbohydrate Research 339 (2004) 715–717.
[2] Jean Yves Reginster, The Lancet 357 (2001) 1617.
[3] Jin-Won Kim, Soo-Un Kim, Heui Sam Lee, et al. Journal of Chromatography A, 1002 (2003) 93–99.
[4] 姜永涛, 陈继永, 刘珂, 药物分析杂志，25(1)(2005) 27-29.
[5] Yasser S. El-Sahartya, Ahmed Abdel Bary, Analytica Chimica Acta 462(2002) 125–131.
[6] Yu Shao, Rama Alluri, Mike Mummert, et al. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 35 (2004) 625–631.

HPLC-ELSD Application for Impurity Determination of 1-Deoxynojirimycin, Glucose and Glucosamine
Liu Zhen，Yin Guoyin，Gong Youxiang，Zhao Ning
（WuXi Pharmatech Co. Ltd，Shanghai，200131）

Abstract：A high performance liquid chromatographic method was developed and presented here for impurity determination of 1-deoxynojirimycin, glucose and glucosamine. Mobile phases are acetonitrile and water containing trifluoroacetic acid and the analytical column is Waters Atlantis HILIC Silica column (5μm, 150×4.6mm). Evaporative light scattering detector (ELSD) is utilized through the study. Method validation data shows the method has a good linear correlation between the peak responses and concentrations of 1-deoxynojirimycin, glucose and glucosamine from 0.008 to 0.04mg/mL. The correlation coefficients are 0.9993，0.9998，0.9996 for 1-deoxynojirimycin, glucose and glucosamine, respectively. The limits of detection (LOD) for 1-deoxynojirimycin, glucose and glucosamine are 22.5，20.0，19.6 ng, respectively. The relative standard deviation (RSD) at 0.02 mg/ml, 0.04 mg/ml and 0.08 mg/ml is less than 10%, indicating a satisfactory reproducibility. It could be concluded that the HPLC-ELSD method presented here can be used for the impurity determination of 1-deoxynojirimycin, glucose and glucosamine.
Keywords：1-Deoxynojirimycin; Glucose; Glucosamine; High Performance Liquid Chromatography (HPLC); Evaporative Light Scattering Detector (ELSD); Impurity Determination