高效液相色谱法测定四黄膏中大黄素、大黄酚的含量
刘起华 张萱 文谨（中国中医研究院广安门医院 北京 100053）

摘要：目的 测定四黄膏中大黄素和大黄酚的含量。方法 采用高效液相色谱法，C18色谱柱为固定相，甲醇-0.1%磷酸溶液（90：10）为流动相，254nm为检测波长，柱温为室温。结果 大黄素在1.6ug-8.0ug、大黄酚在3.2ug-16.0ug范围内，峰面积与其浓度呈良好线性关系(r=0.9997和r=0.9999）。平均回收率为102.77%和101.53%，RSD为1.98%和1.56%。（n=6）。结论 该法简单准确，重现性好。。
关键词：四黄膏；高效液相色谱法；大黄素；大黄酚

Determination of Emodin and Chrysophonol in Sihuang Gao by HPLC
Liu Qihua ,Zhang Xuan ，Wen Jin
(Guanganmen Hospital,China Academy of TCM ,Biejing,100053)

Abstact : Objective Aim to determination the contents of emodin and chrysophonol in Sihuang Gao 。Method HPLC method was used . A Spherixorb C18 column was used with methanol and 0.1% phosphoric acid solution (90:10) as mobile phase. The flow rate was 1.0ml..min-1 and detection wavelength 254nm. Results The calibration curves were liner in the range of 1.6ug-8.0ug and3.2ug-16.0ug for emodin and chrysophonol ,. r=0.9997 and r=0.9999, average revovery rate of emodin and chrysophonol were 102.77% and 101.53%, RSD were 1.98% and 1.56% （n=6）. Conclusion The method was simple, accurate and easy to operate .
Key words : Sihuangao ; HPLC; emodin; chrysophonol

    四黄膏主要由大黄、黄连等组成的中药复方制剂，具有清热解毒，消肿止痛之功效，我院临床应用多年，治疗热毒疮疖等，颇有疗效。本文运用高效液相色谱法对其大黄中的大黄素和大黄酚进行了含量测定，为该制剂的质量控制提供快速准确的测定方法。
1仪器与试药
    日本岛津LC-10A液相色谱仪；检测器SPD-10A；威玛色谱工作站。对照品大黄酚和大黄素（chrysophonol and emodin）购置于中国生物制品检定所。水为高纯水；甲醇为色谱纯。其余试剂为分析纯；四黄膏本院制剂室提供（批号：040822，041128，050110）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
    色谱柱为Spherixorb C18; 流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（90：10）；流速：1.0ml.min-1；检测波长：254nm ; 柱温：室温。
2.2 对照品溶液的配制
    分别称取大黄素和大黄酚2mg和10mg, 精密称定，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成对照品贮备溶液。
2.3 标准曲线制备
2.3.1大黄素标准曲线的制备 分别精密吸取大黄素贮备液1.0、2.0、3.0、4.0 、5.0ml, 置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取5ul，注入液相色谱仪，每个浓度进样3次。按上述色谱条件测定，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为Y=22，122.6X—14.9，r=0.9997; 大黄素在 1.6ug-8.0 ug范围内呈良好的线性关系。
2.3.2大黄酚标准曲线的制备 分别精密吸取大黄酚贮备液1.0、2.0、3.0、4.0 、5.0ml, 置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取5ul，注入液相色谱仪，每个浓度进样3次。按上述色谱条件测定，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为Y=27，493.6X+345.8，r=0.9999;大黄酚在3.2ug-16.0 ug范围内呈良好的线性关系
2.4稳定性试验
    取同一份供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、16、24h进样（n=7）,RSD为0.74%。表明供试品在24h内是稳定的。
2.5重现性试验 分别取同一批样品共5份，每份约1g，精密称定，按“样品测定”项下方法制备供试品溶液。测定并计算大黄素和大黄酚的含量，平均为0.1604 mg/g和0.3399mg/g, RSD为0.83%和1.10%（n=5）表明重现性良好。
2.6 精密度试验
    吸取同一份供试品溶液，连续进样5次，每次5ul, 测得大黄素和大黄酚的峰面积平均值为 53452和148584 RSD为0.75%和0.98%（n-5）,表明精密度良好。
2.7加样回收率试验
    取已知含量的同一供试品6份，每份约0.2g，精密称定，分别精密加入大黄素和大黄酚对照品溶液，按“样品测定”项下方法制备供试品溶液并测定，计算平均回收率为102.77%和101.53%，RSD为1.98%和1.56%（n=6）

2..8空白对照液的配制
    按处方配比除去大黄，并按“样品测定”项下方法制备，得到一空白对照溶液，按上述色谱条件测定，结果见图1。
2.9 样品测定 取供试品1g，精密称定，，置100ml锥形瓶中，精密加入甲醇25ml, 称定重量，加热回流30min, 放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加水15ml使溶解，再加盐酸1ml，超声处理5min,加热回流30min, 立即冷却，置分液漏斗中，用少量乙醚洗涤容器，并入分液漏斗中，用乙醚分3次振摇提取，每次15ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加入甲醇使溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。用0.45um滤瞙过滤，取续滤液作为供试品溶液。
    分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5ul，注入高效液相色谱仪，按外标法计算供试中大黄素和大黄酚的含量。测定结果见表3。高效液相色谱图分别见图1

    以多种比例甲醇-0.1%磷酸溶液（70：30；80：20；90：10）试验选择流动相，当比例为90：10时，大黄素和大黄峰色谱峰分离度大于2，基线平直，峰形较对称。
    本方法操作简便，结果准确，可用于该制剂中大黄素和大黄粉的含量测定。
3.讨论
    以多种比例甲醇-0.1%磷酸溶液（70：30；80：20；90：10）试验选择流动相，当比例为90：10时，大黄素和大黄峰色谱峰分离度大于2，基线平直，峰形较对称。本方法操作简便，结果准确，可用于该制剂中大黄素和大黄粉的含量测定。

参考文献：中国药典【s】。一部，2000：18