影响胍变α-胰凝乳蛋白酶在高效疏水相互作用色谱
上复性效率的因素
申烨华　 白泉 卫引茂 王海波 耿信笃*
（西北大学现代分离科学研究所，陕西省重点实验室 西安 710069）

近年来随着蛋白折叠及体外复性研究的不断深入，已有很多的蛋白复性方法相继产生，其中色谱法因为可被用于工业化生产而受到研究者的广泛重视。2000年，我们对用液相色谱进行蛋白复性的新进展进行了评述[1]。然而，并非所有变性蛋白都能用液相色谱法复性，所以，有必要对影响变性蛋白色谱复性的因素进行研究。本文以难复性的α–糜蛋白酶（α–Chy）为例，研究了影响胍变α–Chy在高效疏水相互作用色谱上复性效率的因素，取得了较满意的结果。
变性方法的影响 研究表明，变性蛋白的聚集是降低蛋白复性效率的主要因素。为了减少变性蛋白的聚集，过去已报到的众多方法大都是在蛋白复性的过程中采取措施防止或减少蛋白聚集。为了在源头上减少变性蛋白的聚集，本文对蛋白的变性方法进行了研究。将蛋白共溶剂PEG600和四氢糠醇 (THFA) 以及疏水填料加入变性剂中使α–Chy变性，以防止或减少这一操作单元中蛋白的聚集，并自行设计进样系统以使样品顺利进入色谱系统。实验结果见表1。由表1可见，1.7mol/L GuHCl中加入蛋白共溶剂或疏水填料均可有效提高胍变α–Chy的复性效率，其中加入THFA填料时提高最多，增加了22.3%。

表1 不同样品经HPHIC后α-Chy的活性回收率

   固定相的影响 由表1可见，1.7 mol/L GuHCl中加入不同疏水色谱固定相，过柱后胍变α–Chy的活性回收率不同，THFA填料>苯基填料>PEG 600填料。将1.7 mol/L GuHCl + THFA填料作为变性剂使α–Chy变性后，经过THFA柱、苯基柱和PEG600柱，胍变α–Chy的活性回收率分别为56.0%，38.3%，30.8%，与表1规律一致。由表1可见，固定相对变性蛋白的不可逆吸附是导致复性效率下降的又一因素。
流动相的影响 将去离子水配制的6mg/ml的α–Chy分别加入HPHIC的A液[2.5mol/L (NH4)¬SO4 + 0.05mol/L KH2PO4 (pH=7.0)]，和B液[0.05mol/L KH2PO4 (pH=7.0)]中，α–Chy的活性回收率下降了38.4%和23.4%。在蛋白进柱前，整个体系是用A液平衡的，所以流动相使蛋白失活的因素不容忽视。

参考文献
1. 郭立安，耿信笃，生物工程学报，2000, 16(6): 1~6