蛋白折叠液相色谱法
耿信笃，王超展，白泉
（西北大学现代分离科学研究所，现代分离科学陕西省重点实验室，西安 710069）

    液相色谱（LC）与蛋白折叠(protein folding)是化学和生物化学中分别使用的两个术语，而蛋白折叠液相色谱法却是一个鲜为人知的专用名词。1997年英国剑桥大学的一个研究小组曾提出再折叠色谱(refolding chromatography)[1]，1999年又提出氧化再折叠色谱(oxidative refolding chromatography)[2]，目的在于表明这是一个新的特别的方法。然而这两个术语不仅不确切，而且没有对它们下定义。这里讲的蛋白折叠液相色谱法，不仅是指在操作上将含变性蛋白样品溶液进样到LC柱上，再从流出液中接收目标蛋白的这样一种简单的操作方法，而是包含着如何将变性蛋白复性这样一个复杂过程在色谱柱上完成，结合色谱有很好的分离效果的特点，达到单独用通常复性方法和单独用通常的液相色谱法无法达到的蛋白复性并同时纯化的效果。因此蛋白折叠液相色谱法（protein folding liquid chromatography, PFLC）可以定义为：有液相和固相起协同作用的，能实现蛋白折叠并满足质量控制所涉及到的多种物理及化学过程的液相色谱法。这个定义包括了四个方面的内容：一是固相和流动相各自及其二者的协同作用对蛋白折叠均有不同贡献；二是必须能使目标蛋白完全或部分完成了折叠；三是所讲的质量控制包含正确折叠中间体和天然构象蛋白的形成，错误折叠中间体向正确折叠中间体的转换以及正确折叠的蛋白与错误折叠的蛋白中间体的色谱分离。四是所指的多种物理或化学过程包括生成沉淀和溶解，氧化和还原，酸碱中和，缔合和解离等。由此看出，蛋白液相色谱折叠法不仅是一种新的蛋白折叠方法，而且是一种新的液相色谱方法。
    一个理想的PFLC具有四种功能，即除变性剂，变性目标蛋白复性，与杂蛋白分离，便于回收变性剂，从而达到“一石四鸟”的效果。一般只要20~40分钟就能完成一个色谱过程。此外，因所用流动相可以连续改变其组成，故多种变性蛋白会各自“选择”适合自己的复性条件，一次色谱过程可使多种蛋白同时复性并实现纯化。
    1991年作者之一等[3]用高效疏水色谱法（HPHIC）对重组人干扰素-γ（rhIFN-γ）进行了复性并同时纯化，虽然当时得到的目标产品的纯度仅85％，但比活已高达5.7107IUmg-1。这一科学上的重要发现表明LC法有可能成为一种新的蛋白折叠工具。1994年，捷克、美国和日本的科学家分别用离子交换法(IEC)[4]、凝胶排阻色谱法(SEC)[5]和亲和色谱法(AFC)[6]成功地对变性蛋白进行了复性。1997年英国剑桥大学的一个研究组将分子伴侣、二硫键氧化酶和脯氨酸顺反异构酶三种组分键合在固定相表面后，用其对Cyclophilin进行了复性，而用其它方法根本无法复性Cyclophilin[7]。
    为使PFLC操作简单化，我们研究开发了蛋白复性并同时纯化装置（Renaturation and purification of proteins，USRPP），或称其为色谱饼（chromatographic cake）[8]，使得PFLC的工业化成为可能。2000年我们首次测定了变性蛋白在用于变性蛋白折叠的HPHIC固定相表面的折叠自由能[9]，并发现固定相表面为变性蛋白分子能提供较高的能量。在此基础上，2001年我们又发表了“疏水色谱对变性蛋白复性并同时纯化机理及应用”[10]。这一研究从微观上阐明了用HPHIC进行蛋白折叠的分子学基础，认为固定相、流动相以及二者间的协同作用促使变性蛋白折叠。2004年作者之一等发表了关于用HPHIC在工业规模上对rhIFN-γ进行复性并同时纯化的报道[11]。这是首次在工业生产中用PFLC法对变性蛋白进行复性并同时纯化。
    PFLC的原理是利用目标蛋白和变性剂在色谱过程中的洗脱时间不同，使得目标蛋白分子周围的变性剂被除去或使其浓度降低，从而使目标蛋白复性，利用变性蛋白在凝胶孔中的分散（SEC）或变性蛋白与固定相之间的相互作用（HIC、IEC、AFC）使得变性蛋白分子被相互隔离，从而降低了变性蛋白分子间的聚集和沉淀，使质量回收率和活性回收率得到提高。另外，PFLC中的液固界面可以为蛋白折叠提供较高的折叠自由能，以促使其顺利复性。
对于蛋白质的色谱复性，存在一个严重的问题：在进样的时候会形成聚集。如果聚集发生了，色谱柱的反压会明显升高，甚至会将色谱柱堵住，使复性操作无法进行。在大规模LC复性中，这一问题显得更为重要。本实验室设计开发的蛋白复性并同时纯化装置（USRPP，图1）能够较好地克服上述缺点，其最大优点是，除了仍具备通常色谱柱所具有的 “一石四鸟”功能外，还能在进样或色谱过程中形成沉淀的条件下，进行正常的蛋白复性和纯化。为了降低设备的成本，使更多的人能够使用变性蛋白复性及同时纯化技术，我们又研制出一种快速蛋白纯化柱（图2）。这种色谱柱具有与USRPP类似的优点，可以用于蛋白复性并同时纯化的条件摸索和实验研究。

   这里仅举一个例子说明PFLC在大规模上变性蛋白进行复性并同时纯化中的应用。2004年我们报道了用HPHIC对rhIFN-γ工业生产工艺进行重大改进的结果[11]，如图3所示。图1A中虚线方框表示的是包括四步的传统生产工艺，总共需要44小时才能得到纯度为95%的产品。生物活性回收率是盐酸胍抽提液中总生物活性的2.6倍。图1B中的虚线方框表示的是作者等所提出的只有一步操作的新生产工艺，只需3小时就可获得纯度超过95%的rhIFN-γ。而且，生物活性回收率是盐酸胍抽提液中总生物活性的62倍。表明PFLC在重组蛋白生产中具有很大的优势和应用价值。

参考文献：（略）