反相高效液相色谱法测定饲料中的激素多残留
李丹妮1，练鸿振2，曹莹1，黄士新1
（1上海市兽药饲料监察所，上海市虹井路855弄30号，上海 201103，
2南京大学现代分析测试中心，南京市汉口路29号，南京 210029）

   畜牧业生产中常使用激素药物[1]，目的促进生长发育，增加体重和同步发情等作用。一般通过饲料添加剂或皮下置入等方法摄入动物体内，在食用组织中尽管含量甚微，但一旦进入人体，将造成激素残留而影响人体。激素残留[2]会造成人体内激素含量增加，从而破坏机体的正常生理平衡而呈现不良后果。目前免疫学方法应用广泛，但只能作为筛选方法。而液相色谱－质谱联用是目前最可靠的确证方法，本文旨在先行建立饲料中激素多残留分离分析的HPLC-UV方法，为建立LC-MS确证方法打下方法学基础。
1 实验部分
1.1 仪器及色谱条件
Waters Alliance 2695型高效液相色谱仪，配有996型二极管阵列（PAD）检测器。色谱柱：Symmetry C18 (Waters), 5 m, 250×4.6 mm (I.D.)；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm, 280 nm；进样量：10 L。流动相梯度洗脱条件：乙睛/水，40/60（v/v，保持15min） 50/50（保持5min） 75/25（保持10min）。
1.2试剂和样品
甲醇（HPLC级）；乙腈（HPLC级）；其他试剂均为分析纯；实验中流动相和溶液用水均二次重蒸水。醋酸甲羟孕酮对照品、丙酸睾酮对照品、双烯雌酚对照品、地塞米松对照品、可的松对照品、雌二醇对照品、己烯雌酚对照品七种激素对照品分别购自Sigma-Aldrich、Fluka和USP公司，含量均高于95％。
2 结果与讨论
2.1色谱图
在本文的色谱条件下，七种激素的混合标准溶液色谱图如下：

2.2 线性范围及检测限
在激素浓度0.0001~0.1 mg/mL（雌二醇浓度为0.0003~0.1 mg/mL，分别在254 nm和280 nm下进行实验）范围进行实验，取标准溶液10 L进样，以峰面积对浓度作图，得到各激素在浓度0.0002~0.1 mg/mL（雌二醇浓度为0.0012~0.1 mg/mL）呈良好的线性相关，相关系数均大于0.999。
2.3 回收率实验
样品前处理步骤：称取研磨后的饲料样品2.00 g于50-mL离心管中，加入20 mL二氯甲烷，超声提取10 min，用滤纸过滤，滤液收集在梨型瓶中。在离心管中再加入20 mL二氯甲烷重复提取一次，合并滤液，旋转蒸发（50℃）至干。用3 mL甲醇溶解，氮吹至干。加入1 mL甲醇溶解，经0.45 m的有机相滤膜过滤后，取10 L进样测定。回收率为65~90％。
色谱图见图2~3，分别为254 nm和280 nm条件下，激素含量为0.002 mg/mL时的混合标准品加标回收色谱图。

2.4 结论
本文建立了同时测定饲料中七种激素的反相高效液相色谱法，方法中采用梯度洗脱条件，流动相组成简单，分析速度快，回收率情况令人满意，为下一步进行液质联用确证方法开发提供了有利条件。

参考文献：
[1] 赵月兰, 姜建华, 四川畜牧兽医 1994, 3, 60.
[2] 张华, 贵州畜牧兽医 2003, 27, 6.
[3] 中国兽药药典, 2000版.

联系人：李丹妮
详细通信地址：上海市虹井路855弄30号
联系电话：021－62688731
传真号码：021－62695763
E-mail地址：yure@yeah.net