梯度洗脱液相色谱中蛋白质的累加进样分离法
常建华1，2 梁峰2 郭立安1
（1. 西安交大保赛生物技术股份有限公司，西安710054；2.西北大学化学系,西安 710069）

     一般一次分离过程只能进一次样。但在蛋白质的梯度洗脱色谱中，一次分离中可多次进样，蛋白质的保留时间及峰形无可觉察的变化。这种进样法可以叫累加进样法。累加进样法在提高蛋白质和生物大分子的分析灵敏度、提高柱子的处理量、节省溶剂和提高分离制备效率方面有十分明显的效果和广泛的应用前景。
1.蛋白质洗脱曲线有明显的突跃区
    王俊德等人和作者报道了在梯度洗脱的反相色谱、离子交换色谱和疏水色谱中，蛋白质洗脱曲线会有明显突变的现象[1~6]。在曲线某一处，B液一个较小的变化，会引起容量因子很大的变化。

    蛋白质的保留值与洗脱液中强洗脱剂之间的关系为[9]：k’=I/[D]Z 。蛋白质的Z值在几十到几百，故k‘与[D]的上百次方成反比。在一定的[D]值附近，[D]值一个较小的变化，会引起k’较大的改变。到了一定的B%值，k‘可以变得非常大，以此时的洗脱液组成进行洗脱，蛋白质实际上在柱子中没有任何可觉察的移动。
2.蛋白质在累加进样分离中保留值和峰形无可觉察的变化
   我们发现，在一次分离中的某一段时间范围内可以多次进样，而蛋白质的保留时间与峰形无可觉察的变化。这种方法叫做累加进样分离法。

3.选择性保留累加进样分离法
   选择在一定洗脱强度的A液中进样，进样后并不开始梯度洗脱，而仍然用A液洗脱。此时保留弱的蛋白质已经达到或接近突变区，在进样后被较快地洗脱，而保留强的蛋白质还远离突变区。待保留弱的蛋白质完全洗出柱子后再进第二次样，如此重复进样多次后再开始梯度洗脱，分离并收集所需的组分。实验发现，保留强的蛋白质保留值与常规进样一致。这种方法可以叫做选择性保留累加进样分离法。见图7。
在一个蛋白质样品中，如果待分离的目标产品保留值比杂质的保留值大，让保留较小的杂质在进样后到第2次进样前随A液流出柱子，多次进样后再开始梯度洗脱，收集目标组分。如果待纯化的目标产品保留值比杂质都小，可以让目标产品在每次进样后随时随A液流出柱子，并进行收集，多次进样后，再用强洗脱剂洗脱杂质。在这两种情况下，部分物质随A液流出，不吸附在柱子上，等于增大了柱子的处理量，扩大了柱子有效容量。同时还可以浓缩样品，节省时间和洗脱剂，解决一次进样体积受限制的问题。
   例如尿激酶的粗品中含有大量的杂蛋白，常规进样时活性回收率74.3%，回收液蛋白质的浓度为10.2mg/ml；而用选择性保留累加进样分离法时，活性回收率83.4%，回收液蛋白质的浓度为34.3mg/ml。见图8。
郭立安、朱宝泉将此方法用于了重组人干扰素的分离中。提高A液的洗脱能力，采用累加进样分离法，可将大部分杂蛋白洗脱掉。此操作既能分离，又可实现良好的蛋白复性[10]。

4. 累加进样分离的条件选择
   在累加进样分离时蛋白质的保留时间与峰形无可觉察变化的直观解释是，梯度开始前到梯度开始后的一定时间内，蛋白质的容量因子非常大，蛋白质还远离其洗脱突变区，溶质在柱子上实际不移动。例如，当色谱条件是聚乙二醇配基的疏水作用色谱固定相、流动相A为3mol.L-1 (NH4)2SO4加10mmol.L-1 PBS(pH=7)、 流动相B为10mmol.L-1 PBS(pH=7)的时候，溶菌酶k’=1.27×105；胰岛素 k‘=8.1×106；细胞色素C k’=1.8×102。在这样的条件下，进样后到梯度开始前的很长时间范围内溶质k‘很大，在柱子上实际不移动。实验证明，即使在梯度启动前40min进样与正常进样对照，这3个蛋白质的保留时间无可觉察的变化。
   同一个组分多次累加进样分离时表观上出一个峰，实际是为重叠的多个峰，且有一个时间差ΔtR。张维冰、许国旺等人得出出峰时间差ΔtR为[11]：
    出峰时间差ΔtR与进样时间差Δt成正比，而与洗脱剂的变化速率Cu、死时间t0、等浓度洗脱时的容量因子k’0近似成反比，也与Z有关[11]。为了保证小的ΔtR，可以通过进样时间差Δt、容量因子k’0等来调节。
5.用累加进样分离法可以浓集样品，提高分析灵敏度
   当蛋白质样品的浓度很稀，HPLC常规分析很难检出时，可以采用累加进样分离法多次重复进样，再开始梯度分离。采用此方法，可在一次分离中完成蛋白质的浓集、分离或分析，提高分析的检出灵敏度。即使样品的浓度低于检出下限时也可以被检出。作者曾对常规分析难以检出的尿激酶样品，在累加进样5次后，可以检出尿激酶的两个不能完全分开的峰。
6.结论
6.1蛋白质在梯度洗脱的液相色谱中，以k’对B%作图的洗脱曲线有突变区。6.2在达到突变区前，蛋白质可多次累加进样，保留值及分离度无可觉察的变化。6.3选择性保留累加进样分离法是一种很有用的方法。在蛋白质的分离制备中应用，可以浓缩样品，提高柱子处理量，节省时间和费用。6.4当样品太稀，无法分析检测时，用累加进样分离法可以同时完成样品的浓集和分析，提高分析灵敏度，解决在一次进样时无法进很大体积的样品的问题。