反相高效液相色谱法测定枇杷花中齐墩果酸和熊果酸含量的方法研究
张晓喻 黄春萍1 黄欢1 张宏1*
(1. 四川师范大学生命科学学院，成都 610068；)

摘要： 目的：建立了运用RP-HPLC测定枇杷花中2种五环三萜类化合物——齐墩果酸、熊果酸的含量的方法。方法：以RP-C18色谱柱为固定相，甲醇：pH3.4的醋酸溶液（94：6）为流动相，流速为0.50mL/min；紫外检测波长为210 nm。结果：齐墩果酸、熊果酸的标准曲线范围分别是25.34～506.80 mg/L、9.10～182.00 mg/L (r = 0.9996, 0.9996 , n=6)；检测限分别是0.6335 mg/L、0.4550 mg/L；加样回收率为98.35%~103.80%， RSD小于1.0%。结论：运用该方法测定齐墩果酸、熊果酸的含量稳定可靠，重现性好。
关键词：高效液相色谱法；枇杷花；齐墩果酸；熊果酸。
    齐墩果酸（Oleanolic acid，OA）毒性很低，具有多种生物活性—— 抗病毒、消炎、增强免疫和免疫调解、抑制血小板凝集、降血脂、降糖、保肝、护肾、抗艾滋病毒等作用；对恶性肿瘤化疗造成的免疫功能下降的恢复和对抗结核药物的肝损害的保护意义重大[1]。熊果酸(ursohc acid，UA)，毒性小，具有多种生物学活性，尤其是在抗肿瘤、抗氧化、保肝、降血脂方面作用显著[2 ]。因此二者都有较高的开发和应用前景。
    药典方法中齐墩果酸和熊果酸的提取来源主要是枇杷叶、女贞、白花蛇舌草及车前草等，而对于以枇杷花为原料提取及检测齐墩果酸和熊果酸的研究几乎未见报道[3]。枇杷在我国药用具有悠久的历史,化痰止咳和胃降气,枇杷花味淡、性微温,用于伤风感冒、咳嗽、痰血[4 ]，在我国浙江、江苏、四川、广西等地大规模种植。在栽培种植过程中，枇杷花大量被疏掉，未被有效利用而造成资源浪费。我们检测了枇杷花中的齐墩果酸和熊果酸，并对其含量进行了方法学的研究。
1 实验
1.1仪器与试剂
    美国DIONEX高效液相色谱仪[ASI-100 Auto Sampler Injector 、P680A HPLC Pump、PDA-100 Photodiode Array Detector、 TCC-100 Column Thermostat、固定相为Alltech Apollo C18 （250 mm×4.6 mm，5 um）]，KQ3200B型超声波清洗器， Millipore 超纯水器，滤膜为SERIAL NO.0952， ESJ120-4万分之一，SHIMADZU UV-1700紫外分光光度计。
熊果酸 (批号：110742-200516)、齐墩果酸 (批号：110709-200304) 对照品由中国药品生物制品检定所提供；甲醇为色谱纯，美国Fedia公司，其他药品为分析纯。
枇杷花样品产地和采收时间见表1。 
1.2 方法
1.2.1标准溶液的配制
精密称取齐墩果酸25.34㎎、熊果酸9.11㎎置于50 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，配置成0.506 g/L齐墩果酸和0.182 g/L熊果酸的混合标准溶液摇匀，作为对照品储备液。
1.2.2标准曲线的绘制
分别精密吸取上述对照品储备液0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL于10 mL容量瓶中，用流动相稀释定容。在上述色谱条件下，进行测定，进样体积为10μL。以峰面积（A）为纵坐标，进样浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线。
1.2.3 精密度和检测限的测定
    分别选取上述对照品混合溶液，在上述色谱条件下测定日内和日间精密。精密度用RSD表示，其计算方法如下：RSD= [标准偏差/平均值]×100%。
    精密量取上述标准曲线中浓度最小的混合对照溶液适量，加流动相逐步稀释后，进样10μL，直到峰高约为基线噪声的3倍，分别得出齐墩果酸和熊果酸的最低检测限。
1.2.4 样品制备
精密称取样品0.5g左右，置于10 mL容量瓶中，滴加95%乙醇9 mL浸润，超声波清洗仪中超声处理15 min，用95%乙醇定容至10 mL。在上述色谱条件下进样，进样体积为10μL，根据峰面积计算样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。
1.2.5 加样回收率的测定
准确称取一定量的已知含量样品于10 mL容量瓶中，分别加入齐墩果酸和熊果酸标准溶液，滴加95%乙醇7～8 mL 浸润，超声波清洗仪中超声处理15 min，用95%乙醇定容至10 mL。按照上述色谱条件进样，进样体积为10μL。根据测定结果和计算值得出加样回收率。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件
    实验结果表明最佳检测条件是以RP-C18色谱柱为固定相，甲醇：pH3.4的醋酸溶液（94：6）为流动相，流速为0.50mL/min；紫外检测波长为210 nm。色谱图见图1。

2.2 标准曲线、线性范围及检出限
   在上述最佳色谱条件下，采用逐步稀释法测得齐墩果酸和熊果酸的检出限。它们的标准曲线方程、线性范围、线性关系及检出限见表2。

2.3 日内精密度和日间精密度
   按照上述色谱条件，分别以齐墩果酸、熊果酸标准溶液测定日内和日间精密度，结果见表3~表4。

2.4 样品处理条件的选择
   精密称取样品2 g，分别用索氏提取法，回流法及超声提取法提取。乙醇提取液经HPLC检测比较，结果表明超声提取法效果更好。
2.5回收率
   以编号为P6的样品进行加样回收实验，实验结果见表5~表6。结果表明该方法的测定结果是可信的。

2.6不同产地齐墩果酸和熊果酸的含量测定
   在上述最佳色谱条件下，对六种不同产地的枇杷花中齐墩果酸和熊果酸进行高效液相色谱测定，结果见表7。

讨论
   枇杷别名卢橘，为蔷薇科枇杷属植物，是我国亚热带地区的珍稀水果。研究分析表明，枇杷花营养丰富，含有钙、铁、锌和1 8种氨基酸，尤其枇杷花含有三萜皂甙等药用成分，具有化痰、止咳，防治头痛、伤风等功效。但枇杷花的开发利用此前尚未有人涉及，致使这一宝贵的资源没有产生应有的效益。枇杷作为传统中药,对其叶、果、果核的研究有比较多的报道[5 ]，我们的实验结果表明：枇杷花中含有一定量的齐墩果酸和熊果酸，与其它药材中的含量相差不大[6,7 ]，提取也较简便快速。 枇杷花作为齐墩果酸和熊果酸的提取来源有着资源广泛、来源容易等优点，同时又解决了在农业产业化过程中资源的合理、有效及综合利用。
参考文献：
1 王德仁．齐墩果酸研究新进展．天津药学，2003 15（3），56
2 殷晓东，赵浩如．中华实用中西医杂志， 2004 4（17），3880
3 成丽，高朝霞，陈凌亚，吴维碧．枇杷花三萜皂甙的分离与鉴定．中国野生植物资源, 1999,18（2）,50
4 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(第二版).北京:人民卫生出版社,1996:504
5 周宁，颜红．枇杷叶不同炮制品中熊果酸含量的测定．广东药学，2005 15（3），3
6 石心红，郭江宁，翟静华．HPLC法测定女贞子中齐墩果酸、熊果酸的含量．海峡药学，2005 17（4），41
7张才华，郭兴杰，李芳，薛秀峰，李发美．HPLC法测定白花蛇舌草中齐墩果酸、熊果酸的含量．沈阳药科大学学报，2004 21（5），358

Determination of Oleanolic acid and ursolic acid in Flowers of Eriobotrya japonica by HPLC analysis
Zhang Xiao-yu , Huang Chun-ping , Huang Huan , Zhang Hong
( The college of science, Sichuan normal university, Cheng Du )

BSTRACT：OBJECTIVE T0 establish an HPlC method for the determination of Oleanolic acid and ursolic acid in Eriobotrya japonica (Thunb．) Lind1．．METHODS The determination was carried out with RP-HPLC on Alltech Apollo C18 column（250 mm×4.6 mm，5 um） with methanol- acetic acid pH3.4 (94： 6) as the mobile phase，and detected at the UV wavelength of 210 nm．RESULTS The calibration curve was in good linearity over the range of 25.34～506.80 mg/L (r = 0.9996, n=6)、9.10～182.00 mg/L (r = 0.9996, n=6)，respectively. The recovery was 98.35%~103.80% with RSD< 1.0%.CONCLUSION The method appeared to be simple,accurate, reproducible.
KEY W0RDS：HPlC； Flowers of Eriobotrya japonica；Oleanolic acid ；Ursolic acid；