生物体液中丙二醛的高灵敏度检测新方法

毛建军1, 2 张红武1 罗佳1 赵睿1 张任恩1 刘国诠1*
1中国科学院化学研究所生命分析化学实验室, 北京, 100080, Email: liugq@iccas.ac.cn
2毛主席纪念堂管理局

    自由基是在机体正常的生命过程中产生的，参与机体的许多重要机能活动。自由基亦被认为是人体衰老和致病的重要因素之一。由于自由基难以直接测定，因此由自由基导致的体内脂质过氧化的程度被广泛用来评价生物体内氧化应激的水平。丙二醛（MDA）是脂质过氧化过程中环过氧化物经β－断裂而生成的，是不饱和脂类过氧化作用的特征产物，因而人们往往把MDA的量作为衡量脂质过氧化程度的指标。
目前常用的MDA检测方法主要有硫代巴比妥酸（TBA）法和2,4-二硝基苯肼（DNPH）法。但TBA法专一性差，且衍生条件剧烈，需要在酸性介质中煮沸若干分钟，因而有可能得到假阳性结果。DNPH法反应条件较温和但操作步骤繁琐，需要有合适的内标物作为定量的参考依据，且灵敏度相对较低；此外，由于DNPH试剂本身不稳定，使用时每天需要重结晶和纯化。因此需要发展一种更加灵敏，更加专一而且操作简便的分析方法，以检测体液中丙二醛的含量。
    本文提出并发展了一种基于MDA与9-芴甲氧羰基肼（FMOC-hydrazine）衍生形成MDA-FMOC-腙的检测体液中MDA的柱前荧光衍生－RP-HPLC分析新方法。实验结果表明：该方法操作简便，衍生条件温和，衍生产物稳定，衍生样品经离心后可直接进样分析；此外，还具有专一性强，灵敏度高的特点。当信噪比为3:1时，MDA的检测限为0.1 pmol。以该方法测定了15名健康男性人体血液中的游离MDA和MDA总量，分别为153±9.6 nmol/L和426±29.8 nmol/L。所测值与文献报导结果相符。

Fig. 2. Typical chromatograms of blank, standard MDA and plasma specimen after derivatization with FMOC-hydrazine. Chromatographic conditions: column: Nucleodur® C18 (250×4.6 mm); detection: Ex=270nm, Em=310nm; mobile phase: acetonitrile:water=53:47; flow rate: 1.0mL/min. (A) Reagent blank; (B) Standard MDA (2.41 nmol/mL); (C) chromatographic separation of MDA and the short-chain carbonyls. Abbreviations of FMOC-hydrazine derivatives with: formaldehyde, FA (0.5 nmol/mL); acetaldehyde, ACT (0.5 nmol/mL); propaldehyde, PRA (1.0 nmol/mL); malonaldehyde, MDA (1.0 nmol/mL). (D) Plasma specimen.

参考文献：
1.HS Lee and AS Csallany, Lipids, 1987, 22:104.
2.RP Bird, SOH Silas, M Hadley, H Draper, Anal. Biochem., 1983, 128: 240-244.
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4.J Pilz, I Meineke, CH Gleiter, J. Chromatogr. B, 2000, 742:315-325.
5.R Agarwal, SD Chase, J. Chromatogr. B, 2002, 775: 121-126.