高效液相色谱法测定甘蓝、青菜和番茄中
虫酰肼、甲氧虫酰肼和呋喃虫酰肼残留
章 虎，吴俐勤*，谢磊，何红梅，朱加虹
(浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)
E-mail：zhanghu@china.com.cn

摘要：建立了同时测定蔬菜（甘蓝、青菜和番茄）中虫酰肼、甲氧虫酰肼和呋喃虫酰肼（福先）农药残留的高效液相色谱法。以酸化甲醇高速匀浆提取，正己烷去除脂类杂质，二氯甲烷反萃取去除亲水性杂质，再经氟罗里硅土柱层析净化，效果显著。采用甲醇-水(75+25，V/V)为流动相，利用Agilent HC-C18柱和紫外检测器（检测波长：230nm）对待测组份进行了分离和测定。实验证明, 添加浓度在0.05mg/kg，0.2mg/kg和1mg/kg时，蔬菜（甘蓝、青菜和番茄）中虫酰肼、甲氧虫酰肼和呋喃虫酰肼平均添加回收率在76.9%～105%之间，相对标准偏差(RSD，n=5)小于10%，虫酰肼、甲氧虫酰肼和呋喃虫酰肼在样品中的最低检出浓度为0.05mg/kg。
关键词: 虫酰肼；甲氧虫酰肼；呋喃虫酰肼；高效液相色谱；残留

The Determination of Tebufenozide, Methoxyfenozide and Fuxian Residues in Cabbage, Pakchoi and Tomato by High Performance Liquid Chromatography
Zhang Hu, Wu Li-qin*, Xie Lei, He Hong-mei, Zhu Jia-hong
(Institute of Quality and Standard on Agricultural Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China)

Abstract: An analytical method for tebufenozide, methoxyfenozide and Fuxian residue detection in cabbage, pakchoi and tomato by high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. Samples were extracted by blending with acidic methanol/water. The extract was purified first by n-hexane to remove some fatty impurities, then extracted with dichloromethane to discard water-soluble impurities, and finally cleaned by Florisil column chromatography. The HPLC conditions : Agilent HC-C18, methanol-water=75:25(V/V) as mobile phase, and UV detection at 230nm.The average fortified recoveries for tebufenozide, methoxyfenozide and Fuxian in cabbage, pakchoi and tomato samples were 76.9%～105%. Relative standard deviation was less than 10%, and the limit of detection of three pesticides in cabbage, pakchoi and tomato samples were 0.05mg/kg, respectively.
Keywords: tebufenozide; methoxyfenozide; Fuxian; high-performance liquid chromatography (HPLC); residue

1 引言
    虫酰肼（tebufenozide，米满，代号RH-5992）和甲氧虫酰肼（methoxyfenozide，美满，代号RH-2485）是美国罗姆-哈斯公司在抑食肼（RH-5849）基础上开发出的新一代双酰肼类昆虫生长调节剂，它们可诱使鳞翅目害虫过早蜕皮，从而相对地快速抑制昆虫进食。[1]虫酰肼和甲氧虫酰肼在我国蔬菜生产中得到广泛使用，对有机磷、拟除虫菊酯类农药产生抗药性的鳞翅目害虫有特效。呋喃虫酰肼（福先）是国家南方农药创制中心江苏基地（江苏省农药研究所有限公司）自主创制发明的双酰肼类昆虫生长调节剂[2]，对甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、小菜蛾、菜青虫等鳞翅目害虫均表现出较高的杀虫活性，2005年3月，农业部全国农技推广服务中心将“福先”列为“农业部重点推广产品”。
但大量使用这些农药的对环境和食品不可避免带来潜在危机，国内外关于虫酰肼和甲氧虫酰肼残留单独检测已有报道[3][4][5]，呋喃虫酰肼残留量的分析方法尚未见报道。在蔬菜上同时测定虫酰肼、甲氧虫酰肼和呋喃虫酰肼残留，国内外未见报道。
    本文采用酸化甲醇高速匀浆提取，液液萃取结合柱层析净化，HPLC测定，方法简便、快速，净化效果很好,各项技术指标均满足农药残留检测的要求。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂和材料
    美国DIONEX Summit高效液相色谱仪（带ASI-100自动进样器、UVD170U紫外检测器、chromeleon色谱工作站4.50版）；高速匀浆分散器(T18，美国VWR 公司)；自动浓缩仪（Büchi R205型，瑞士步琪有限公司）；超声波清洗器( KQ-50B型，昆山市超声仪器公司)。
    虫酰肼，纯度99.9%，美国E.Q.公司；甲氧虫酰肼，纯度98.5%，美国Sigma公司；呋喃虫酰肼，纯度99.5％，江苏省农药研究所提供。
标准储备液：分别精密称取标准品约10.0mg（精确至0.1mg），分别用乙腈溶解并定容于100mL 容量瓶中，各种标准品浓度为100mg/L，4℃冰箱内保存，实验中按需要稀释。
试剂：盐酸、正己烷、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、无水硫酸钠(使用前于150℃条件下烘5h)、氯化钠等均为分析纯，乙腈、液相测定用甲醇为色谱纯，高纯水；
氟罗里硅土（60-100目，美国Sigma-Aldrich 公司，使用前在650℃高温烘4h, 在干燥器内冷却后用5%水脱活备用）；
提取液（甲醇+0.1moL/L盐酸溶液（V/V）=9+1）；
净化柱：200 mm × 15 mm(直径)玻璃柱，底部垫约0.5 cm高脱脂棉，依次填装1 cm无水硫酸钠，5 g脱活氟罗里硅土和1 cm无水硫酸钠。
2.2 色谱检测条件
色谱柱：Agilent HC-C18 (250mm×4.6mm,5μm)，流动相为甲醇+水= 75+25 (体积比)，柱温为室温，流速0.5mL/min，进样量25μL，检测波长230nm，外标法定量。
2.3 实验方法
    称取25 g（精确到0.01g）粉碎的蔬菜样品于匀浆杯中，用量筒准确加入100mL提取液，在匀浆器上高速匀浆提取2分钟，抽滤，用30mL提取液清洗匀浆杯和滤层，滤液转移到500mL分液漏斗中，加入50mL10%氯化钠水溶液与30mL正己烷，振荡，静置，弃去正己烷层，再加入100mL10%氯化钠水溶液与100 mL二氯甲烷，振荡，静置，待分层后将下层液体经无水硫酸钠漏斗转移到250 mL平底烧瓶中，再用50 mL二氯甲烷重复提取一次，合并两次二氯甲烷在40℃水浴、300 mbar真空下浓缩近干，氮气吹干，待净化。
    用20mL正己烷预淋净化柱，待溶剂到达净化柱上端时，用95+5（正己烷+乙酸乙酯）10mL分2次超声溶解平底烧瓶残渣，用胶头滴管转移上柱，弃去淋洗液，然后用75+25（正己烷+乙酸乙酯）10mL淋洗，弃去淋洗液，再用75+25（正己烷+乙酸乙酯）100mL洗脱，收集洗脱液到平底烧瓶中，在40℃水浴、300 mbar真空下浓缩近干，氮气吹干，用流动相少量多次超声、转移定容至5mL，混匀，过0.2μm滤膜，待液相色谱测定。
3 结果与讨论
3.1 流动相的选择与色谱分离效果
    实验中分别对流动相乙腈-水的不同配比，甲醇-水的不同配比进行了比较选择，结果表明，乙腈-水的体积比为55+45条件下,色谱分离效果较好，呋喃虫酰肼与虫酰肼达到基线分离，但分析时间较长，甲醇-水的体积比为75+25条件下，色谱分离效果最好，三种农药达到基线分离，并与杂质分离很好。
    在检测波长的选择上，根据紫外扫描结果，选择虫酰肼、甲氧虫酰肼和呋喃虫酰肼均有较大吸收并且样品杂质干扰较少的230nm作为检测波长，以实现三种化合物的同时测定。在2.2色谱条件下，测得甲氧虫酰肼、呋喃虫酰肼和虫酰肼的保留时间分别为12.552、15.056和17.233min。
    标样和样品添加回收见图1-8。图中1, 2, 3分别代表甲氧虫酰肼、呋喃虫酰肼和虫酰肼。
3.2 线性关系
    从标准储备液中用流动相稀释配制浓度为25mg/L的三种农药混合标准溶液，再用流动相溶液稀释成：0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10mg/L系列浓度的混合标准工作液，按上述色谱条件测定，以峰面积Y为纵坐标，浓度X（mg/L）为横坐标进行线性回归分析，线性回归方程和相关系数见表1。

表1表明，在0.1~10.0mg/L范围内，各组分线性关系良好。
3.3 方法的回收率、精密度及最低检出限
    在未检出虫酰肼、甲氧虫酰肼和呋喃虫酰肼的蔬菜（甘蓝、青菜和番茄）样品中分别添加不同含量水平的3种农药标准液，涡旋混合2分钟，静置30分钟，使添加浓度为0.05mg/kg、0.2mg/kg和1mg/kg，每个水平做5次平行实验，按照样品处理方法处理后进样，计算加标回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表2。此结果回收率良好，相对标准偏差小于10%，符合农药残留检测要求。
    以信躁比S/N>3计算，虫酰肼、甲氧虫酰肼和呋喃虫酰肼的最小检出量为1×10-9g，对于实际样品，甘蓝、青菜和番茄中的最低检出浓度为0.05mg/kg。

4 结论
    本实验以酸化甲醇高速匀浆提取，正己烷去除脂类杂质，二氯甲烷反萃取去除亲水性杂质，再经氟罗里硅土柱层析净化，建立了蔬菜（甘蓝、青菜和番茄）中虫酰肼、甲氧虫酰肼和呋喃虫酰肼残留量同时测定的高效液相色谱法。在选定的最佳条件下，该分析方法对蔬菜中三种农药的添加回收率在76.9%～105%之间，最低检出浓度为0.05mg/kg。
    美国规定虫酰肼在果形蔬菜（Vegetable, fruiting，除葫芦cucurbits）上最大残留限量为1mg/kg[6]；澳大利亚规定甲氧虫酰肼在番茄上为3mg/kg[7]；韩国规定虫酰肼在番茄和韩国甘蓝上为1mg/kg，甲氧虫酰肼在韩国甘蓝上为5mg/kg [8]；日本在即将于今年5月31日实施的“肯定列表”制度中对于虫酰肼和甲氧虫酰肼在大多数蔬菜和水果上都有最大残留限量规定，蔬菜在0.1mg/kg-10mg/kg之间 [9]。我国也已制定了虫酰肼在叶菜上的最大残留限量0.5mg/kg[10]。本研究方法符合残留分析试验要求，能够用于同时检测甘蓝、青菜和番茄等蔬菜中虫酰肼、甲氧虫酰肼和呋喃虫酰肼的农药残留。
参考文献
[1] 冯坚. 双酰肼类昆虫生长调节剂研究开发进展，现代农药，2004，3（2）：4-8
[2] 张湘宁. 新型昆虫生长调节剂-呋喃虫酰肼，世界农药，2005，27（4）：48-49
[3] 美国EPA残留分析方法. 虫酰肼在苹果中的残留测定，http://www.epa.gov/oppbead1/methods/ rammethods/ 1995_014M.tif
[4] 美国EPA环境化学方法. 甲氧虫酰肼在土壤中测定, http://www.epa.gov/oppbead1/methods/ecmmethods/ 446178-23-S.tif
[5] 杨立荣，张兴，陈安良，李广泽. 小白菜中残留虫酰肼的超临界流体萃取条件的研究，色谱，2004，22（3）：263-266
[6] US EPA. Tolerances and exemptions from tolerances for pesticide chemicals in food, http://a257.g.akamaitech. net/7/257/2422/08aug20051500/edocket.access.gpo.gov/cfr_2005/julqtr/pdf/40cfr180.482.pdf
[7] AUSTRALIAN PESTICIDES AND VETERINARY MEDICINES AUTHORITY. Maximum residue limits in food and animal feedstuff, February 2006, http://www. apvma.gov. au /residues/mrl1.pdf
[8] Korea MRLs for Pesticides, http://www.kfda.go.kr/eng/ download/KoreanMRLsforPesticides2005.pdf
[9] Positive List System for Agricultural Chemical Residues in Foods, http://www.mhlw.go.jp/english/ topics/ foodsafety/positivelist060228/dl/n04.pdf
[10] NY 774-2004 叶菜中氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、醚菊脂、甲氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯、四聚乙醛、二甲戊乐灵、氟苯脲、阿维菌素、虫酰肼、氟虫腈、丁硫克百威最大残留限量。