加压毛细管电色谱在微量生物样品分离中的应用
黄晓晶1， 李鹏1， 闫超1,2
1. 上海通微分析技术有限公司，上海 201203
2. 中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连 116011

    加压毛细管电色谱（Pressurized capillary electrochromatography, pCEC）将液相色谱与毛细管电泳巧妙结合，是一种高效的微柱分离技术。它在毛细管中填充液相色谱固定相，依靠电渗流和液压共同驱动流动相，使中性和带电荷的样品分子根据他们吸附、分配平衡常数和电泳速率的不同而达到分离分析的电动色谱分离模式。
    PCEC用于微量、复杂的生物样品分析具有明显的优势：（1）pCEC采用电渗流与压力流共同驱动，不存在液相色谱柱的反压问题，因而可以使用小粒径（1.5m）的色谱填料和较长的色谱柱（50cm）进行分析，分离效率更高，峰形更好，峰容量更大；（2）pCEC是微柱分离技术，容易实现与其他分析技术，如质谱和在线样品处理等技术的联用；（3）pCEC可实现二元溶剂梯度洗脱和连续、快速分析；（4）pCEC可以采用已有的各种液相色谱固定相，并由于分离过程中电泳和分配机理的同时作用，大大提高了对复杂样品的分离选择性。
我们采用TriSepTM-2100型加压毛细管电色谱系统（美国通微分析技术有限公司，Pleasanton, CA, USA）对几种生物提取的抗癌活性肽进行毛细管液相色谱和加压毛细管电色谱的分离，用于对样品纯度和组成的鉴定。TriSepTM-2100型加压毛细管电色谱系统由30kV高压电源、梯度高压输液泵、UV-Vis检测器和微流控制模块等组成，可实施毛细管液相色谱和加压毛细管电色谱等分离模式的操作。
    如图1、图2、图3所示，我们通过毛细管液相色谱和pCEC技术分别对几种提取的抗癌活性肽进行分离，对其纯度和组成进行鉴定。在每组实验中，虽然采用了相同的流动相和色谱柱，但得到的pCEC的分离效果明显优于毛细管液相色谱的结果。由于色谱和电泳双重分离机理的共同作用，再辅以电场改变样品的保留行为，因此，样品在加压毛细管电色谱上可以得到更加细致的分离，分析效果显著改善。

(a)                                               (b)

图1. 抗癌活性肽（脾肽）毛细管液相色谱和加压毛细管电色谱的色谱图

色谱条件：填充毛细管色谱柱（150 μm i.d.×300 mm, C18，5μm, 300A）；流速：0.05ml/min；检测波长：215nm；电压：2kV；流动相：A：磷酸盐缓冲溶液10 mmol，pH=7，B：乙腈95%+5%水，梯度：0-10 min, 30%B；10-45 min, 30%B-75B%；45-55 min, 75%B。（a）毛细管液相色谱分离图，（b）加压毛细管电色谱分离图。

（a）                                                                                 （b）
图2. 抗癌活性肽（肝肽）毛细管液相色谱和加压毛细管电色谱的色谱图

流动相：A：磷酸盐缓冲溶液10 mmol，pH=7，B：乙腈95%+5%水，A：B=30：70；其他条件同图1。（a）毛细管液相色谱分离图，（b）加压毛细管电色谱分离图。

（a）                                                                            （b）
图3. 抗癌活性肽（血清肽）毛细管液相色谱和加压毛细管电色谱的色谱图

流动相：A：磷酸盐缓冲溶液10 mmol，pH=7，B：乙腈95%+5%水，梯度：0-5 min, 20%B；5-45 min, 20%B-75B%；45-55 min, 75%B；其他条件同图1。（a）毛细管液相色谱分离图，（b）加压毛细管电色谱分离图。