鼠肝膜蛋白IAM柱外固定化的影响因素研究
――pH和NaCl浓度的优化
郭琼，马文，屈锋，邓玉林
北京理工大学生命科学与技术学院a，防化研究院第四所b
imhere0719@sina.com

摘要
    IAM（Immobilized Artificial Membrane）由于具有与细胞膜结构的相似结构，作为色谱填料时可固载膜蛋白作为固定相，模拟细胞膜表面情况，用于膜蛋白功能研究，如受体-配体相互作用、药物分子的抑制剂与激动剂的选择等方面 。如何有效地将细胞膜蛋白固载在IAM颗粒上并保持生物活性成为实现这一新技术的关键之处。蛋白质结构性质复杂，易受各种条件影响，如温度、pH和离子强度等。为摸索膜蛋白固定化的最佳条件，本文以鼠肝膜蛋白为例，通过考察其在柱外系列pH和以不同NaCl浓度为指标的系列盐离子强度环境中的固载情况，对影响膜蛋白固定于IAM基质上的两种因素做了初步研究。该结果可为摸索IAM柱内蛋白固定化的最佳条件提供参考。
1． 试验步骤
1.1 鼠肝膜蛋白的制备 根据Neville法 改进：Wister大鼠颈椎脱臼致死，迅速开腹取其肝脏，置于4℃匀浆缓冲液中，洗净血污，用滤纸吸干。于等体积缓冲液中剪碎，再加入3倍缓冲液，匀浆。所得悬液1 000×g离心10min，取上清，8 000×g离心10min，取上清，100 000×g离心20min，取沉淀置于10ml含1％CHAPS的Tris-HCl（pH7.4）中混匀，摇床孵育45min后200 000×g离心45min，收集上清。考马斯亮蓝法 测蛋白浓度。
1.2 膜蛋白柱外固定化 称取5mg IAM于1.5ml 离心管中，加入0.1ml膜蛋白溶液。每管加入0.9ml不同条件的固定化缓冲液，漩涡混匀，冰浴摇床4h，低速离心15min，测上清蛋白浓度。固载前后溶液中蛋白含量之差即为固载蛋白量。
2． 结果与讨论
2．1 pH的优化 其他条件相同时，接近生理环境的pH7～8缓冲液使蛋白固载量较高，而pH5.01下测得的固定化后上清液中剩余的蛋白含量少，很可能是因为大多数的酸性蛋白pI接近5，造成在该条件下蛋白沉淀而非固载在IAM上。
2．2 NaCl浓度的优化 在相同pH条件下，膜蛋白在IAM上的固载量随NaCl浓度不同呈现较明显的变化趋势。0～20mM范围内，蛋白固载量与NaCl浓度成正相关，在20mM浓度下固载量达到最大值29.56μg/mg IAM，随后蛋白固载量随NaCl浓度的增大而减小，到100mM浓度时固载量达到最低值，随后变化趋势较为平缓。

结论：由此结果可知，选取pH7.5左右含50mM Tris-HCl,1mM EDTA,20mM NaCl的缓冲液作为膜蛋白柱内固定化时的流动相，可使蛋白的固载率较高，获得较好的效果。另外，温度和有机试剂的作用都可能影响到蛋白的固定化，而固定化过程中蛋白活性的保存也是一个重要的问题，因此如何监测和保持固载蛋白活性成为日后工作的一个重点。