HPLC-MS测定大鼠血浆中单硝酸异山梨酯
崔新玲 刘国宏 马果花 曲刚莲 李善茂
（防化指挥工程学院分析中心 北京 102205）

摘要：建立了高效液相色谱-质谱法测定血浆中单硝酸异山梨酯浓度的方法。以茶碱为内标，样品在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，高效液相色谱-质谱检测器（MSD）和二极管阵列检测器（DAD）串联在线检测。线性范围为0.03464 ~ 103.0 mg/L，回收率为93.1 ~ 112.0％，日内、日间精密度均小于7％。结果表明该法处理血浆简单，检测结果准确度高，专一性强，适用于药代动力学和生物利用度研究。
关键词：单硝酸异山梨酯 高效液相色谱-质谱
    单硝酸异山梨酯（ISMN）为硝酸异山梨酯的主要活性代谢物，可通过扩张外周血管，特别是增加静脉血容量，减少回心血量、降低心脏前后负荷而减少心肌耗氧量。同时，还可通过促进心肌血流重新分配而改善缺血区血流供应，并且能通过增加宫颈组织的可膨胀性而促进足月产妇的宫颈成熟。为考察单硝酸异山梨酯的生物利用度及代谢动力学参数，本文建立了测定大鼠血浆中ISMN的高效液相色谱-质谱法。有关血中的ISMN测定，文献报道中用气相色谱-电子捕获法的较多[1] [ 2]，高效液相色谱法在制剂中ISMN测定用得较多。
1 仪器与试剂
1.1仪器
    Agilent1100高效液相色谱仪系统，包括1100四元输液泵，离子阱质谱检测器（MSD），二极管阵列检测器（DAD），在线真空脱气机，自动进样器，B.01.03色谱工作站。
1.2试剂
    单硝酸异山梨酯对照品，含量大于99.8％，北京紫竹医药公司；茶碱（内标），Fluka公司；乙腈、甲醇为色谱纯，Fisher公司；乙酸乙酯为色谱纯，Fluka公司；乙酸铵为分析纯，广州化学试剂厂；水为娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。
2方法与结果
2.1色谱条件
    ZORBAX DB-C8 分析柱（5µm，4.6×150mm），柱温30℃；流动相为A：10％的乙腈水溶液（含5mmoL•L-1 乙酸铵），B为纯甲醇，流速为0.4mL•min-1 。
2.2检测条件
2.2.1 质谱条件 采用大气压化学电离（APCI）源，负离子检测方式，干燥气流速5 L/min，温度150℃，毛细管电压4kV；碎裂电压为80V，用于选择离子检测（SIM）定量分析的离子为m/z 250（ISMN，[M+CH3COO] -）和m/z 179（内标茶碱，[M-H]-）
2.2.2 检测波长 茶碱的检测波长为272nm，ISMN检测波长为220nm。
2.3对照品及内标物溶液配制
   准确配制ISMN的甲醇储备液(浓度为866mg/L)及茶碱储备液(浓度为812mg/L)，于4℃冷藏备用；茶碱储备液用甲醇稀释成8.12mg/L作为内标溶液使用。
2.4血浆及组织样品处理
   取血浆1.00mL，加入内标溶液40µL，NaOH（0.25mmol/L）0.20mL，涡旋混匀，加入乙酸乙酯2.00mL 萃取，涡旋混匀3min，离心（3000rpm）5min，取上层有机相，重复提取3次，合并有机相，50℃下用氮气吹干，加入流动相100µL溶解，离心（3000rpm）5min，取上清液进样，进样量为10µL。
2.5线性关系
   分别取不同体积的ISMN储备液和40µL内标溶液，加入到1.00mL健康大鼠的血浆中，使ISMN的最终浓度为：0.03464、0.1732、1.039、10.39、34.64、51.96、86.60、103.0 mg/L；内标均为0.3248mg/L，按2.4方法进行样品处理（不加内标溶液）后进样分析。以对照品峰面积和内标峰面积之比A与相应的对照品浓度c（mg/L）作图进行加权回归（权重为1/c），得ISMN（n=8）的标准曲线方程为A=0.0002c - 0.1344，r2 ＝0.9989，结果表明，血浆及组织中ISMN在0.03464～103.0mg/L范围内线性关系良好。
2.6回收率及精密度测定
   按2.4中所述方法，处理ISMN浓度分别为0.064、0.254、1.03mg/L对照品血浆，进行分析，计算日内、日间精密度及回收率，结果见表1。
表1 单硝酸异山梨酯的日内、日间精密度及回收率的测定

2.7色谱行为
2.7.1 质谱图ISMN采用大气压化学电离源，以负离子方式检测。根据ISMN和内标的质谱图，信号最强的离子峰质荷比分别为m/z 250 和m/z 179，选择质荷比为 m/z 250 和m/z 179的离子进行检测，得到ISMN和内标的选择离子色谱图，见图1。内标和ISMN的保留时间分别为5.2和7.0min。
2.7.2 色谱图 内标用272nm波长检测，ISMN用220nm波长检测，色谱行为见图2。

3讨论
3.1流动相的选择
   测定ISMN的流动相多采用甲醇-水，本实验中分别改变甲醇、乙腈、水的比例进行了实验，结果表明A（10%乙腈水溶液）：B（甲醇）= 70：30时分离效果最佳，为提高ISMN的离子化效率，另外在流动相中加入乙酸铵。
3.2萃取溶剂的选择
实验中分别使用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等作提取溶剂，结果表明用乙酸乙酯提取效率较高，并且杂质不干扰样品测定。文献[3]报道血样处理均在水浴中进行，有机溶剂挥发时间长。本文采用50℃下氮气吹干，通过比较两种方法的提取回收率差别不大。
参考文献：
[1] 黄小芳，朱英姿，崔宝东等． 毛细管气相色谱-电子捕获法测定5-单硝酸异山梨酯血药浓度研究．中国药学杂志，1998，33(10)：608
[2] 夏桂珠，傅贻柯，董善年等．毛细管气相色谱-电子捕获法测定人血清中5-单硝酸异山梨酯血药浓度和药代动力学．药学学报，1994，29(8)：634
[3] ZHANG Qi(张琪)，WANG Guang-ji(王广基)，SUN Jian-guo(孙建国)，et．Determination of aspirin and salicylic acid in human plasma by LC-MS and HPLC-UV(HPLC-MS和HPLC-UV同时测定人血浆中阿司匹林和水杨酸的浓度)．J China Pharm Univ (中国医科大学学报)，2001，32(1)：47

Determination of isosorbide-5-mononitrate in Rats Plasma by HPLC-MS
CUI Xin-Ling LIU Guo-Hong MA Guo-Hua QU Gang-lian LI Shan-Mao
(Institute of Chemical Defense,Beijing,102205)

Abstract: A method for determination isosorbide-5-monnitrate in rats plasma by HPLC-MS was studied. An Agilent MSD equipped with an atmospheric pressure APCI source was used as detector and was operated in negative ion mode. The linear ranges was 0.03464~ 103.0mg/L. The method recovery was 93.1%~112%. The RSD of inter- day and intra-day were less than 7%. Conclusion: The method is convenient, accurate. It was used for therapeutic monitoring and the pharmacokinetics study.
Keywords : isosorbide-5-mononitrate, HPLC-MS