新型固定化pH梯度毛细管等电聚焦方法用于蛋白分离
谢瑶，尹开吉，邓玉林 ，罗爱芹，屈锋
(北京理工大学 生命科学与技术学院 北京100081)

摘要：通过化学键合建立一种新型的固定化pH梯度的方法，用于毛细管等电聚焦分离蛋白质。采用微流控泵驱动毛细管内的聚焦区带,通过调节泵的流量,从而调节聚焦区带的迁移速度。该方法避免了自由溶液聚焦时两性电解质所带来的影响，实现了高灵敏度及检测波长自由选择等优点，适用于两步法毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质等两性电解质。本文考察了对牛血清白蛋白和血红蛋白两种蛋白质混合物的分离，证明了该方法可行。
关键词：毛细管等电聚焦；固定化pH梯度；蛋白分离；化学键合
前言
      等电聚焦[1]（isoelectric focusing, IEF）是一种根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术。Hjerten 和Zhu[2]首次报道了在毛细管内进行等电聚焦（capillary isoelectric focusing, CIEF）的方法之后，CIEF被广泛应用于不同等电点蛋白质混合物的分离[3-4]。随着人类基因组测序的完成和后基因组时代的到来,蛋白质组学的研究受到了广泛的关注[5-6]。由于毛细管等电聚焦对蛋白质及多肽等生物分子具有十分高的分辨率，最近几年来,毛细管等电聚焦(CIEF)在分离蛋白质和多肽等方面显示出十分广泛的应用[7-9],在蛋白质组学的研究中也发挥着越来越重要的作用。
      在自由溶液中进行等电聚焦必须添加较高浓度的两性电解质（CAs）以形成等电聚焦所必须的pH梯度。由于CAs本身是十分复杂的混合物，并且具有较强的紫外吸收，所以使用CAs会带来重现性差，不稳定及检测灵敏度降低的等缺点。通过其它方法[10-12]，如：电解水、热致pH梯度、流体聚焦等进行等电聚焦的技术也有报道，但大多存在所需仪器设备复杂、分辨率低、过程复杂等缺点。
      本文建立了一种新型的固定化pH梯度的方法,用于蛋白质的分离。避免了自由溶液聚焦时两性电解质所带来的影响，实现了高灵敏度及检测波长自由选择等优点。并且采用微流机械泵驱动毛细管内的聚焦区带,通过调节泵的流量,从而调节聚焦区带的迁移速度。实验装置简单,适用于毛细管等电聚焦两步法分离蛋白质等两性物质。通过对含有血红蛋白(hemoglobin)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)两种蛋白质混合物的分离,证明了该方法的可行性。
1、实验部分
1、1仪器试剂
      TriSep TM —2010GV型多功能毛细管电色谱仪（上海通微分析技术有限公司）, 熔融石英毛细管(河北永年锐阳色谱器件有限公司,100μｍ i.d. 375μｍ o.d. 及400μｍ i.d)。DHX-9053B型电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）。载体两性电解质Ampholine（Sigma, pH =3.0~10.0)，异氰酸酯（Sigma公司），血红蛋白和BSA（拜尔迪生物技术有限公司），去离子水本实验自制，其它试剂均为分析纯。
1、2线性聚丙烯酰胺涂层毛细管的制备[13]
1、3异氰酸酯固定化pH梯度毛细管柱的制备（图1）
毛细管预处理：依次用0.1mol/LHCl、蒸馏水、0.1mol/LNaOH、蒸馏水及甲醇冲洗毛细管30min, N2气吹干备用。
异氰酸酯的引入：将0.1mL异氰酸酯和0.1mL三乙胺溶于5ml干燥甲苯中，摇匀。用手动泵注入毛细管中，停留40min后用氮气吹出，置于70°C恒温干燥箱中，反应12h以上。
两性电解质CAS（ pH=3~10）的固定化：依次用甲苯，甲醇，三蒸水，PBS冲柱子10-15min。再用手动泵注入4%CAS溶液（pH=7.0, 20mmol磷酸盐缓冲液溶液中），根据毛细管长度计算电压，以500V/cm进行聚焦。聚焦条件为cathode：NaOH 20mmol/L, anode:H3PO4 20mmol/L，buffer: PBS 20mmol/L pH=7.0。 聚焦完成后毛细管两端用三蒸水封，静置12h以上。

图1.异氰酸酯柱固定化pH梯度毛细管的制备
Fig.1 Preparation of isocyanate immobilized pH gradient capillary

1、4毛细管柱的耦联
   取35cm线性聚丙烯酰胺涂层毛细管,在距负极端25cm处烧制检测窗口。将另一端和70cm固定了两性电解质的毛细管中的负极端，分别插入一段内径为400微米的毛细管两端，紧密连接，再将内径400μｍ毛细管两端用胶密封（图2）。

图2.毛细管等电聚焦装置示意图
Fig.2 Schematic diagram of CIEF
1. polyacrylamide capillary; 2. immobilized pH gradient capillary; 3.capillary joint; 4.UV detector; 5. cathode buffer vial; 6.anod buffer vial; 7. HV: high voltage power supply;

1、5毛细管等电聚焦
样品配置：分别称取血红蛋白（Hb）1.2mg和牛血清白蛋白（BSA）1.5mg溶于1mL缓冲溶液中，混匀。用缓冲液稀释200倍后，经0.22μｍ滤膜过滤待用。
等电聚焦条件：阴极缓冲溶液为20mmol/L NaOH溶液,阳极缓冲溶液为20mmol/L H3PO4溶液，缓冲液为20mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）。用PBS缓冲液平衡柱子后，将样品注满其中，进行聚焦，待电流稳定后停止聚焦。
区带迁移条件：本实验采用流体动力驱动，通过调节微流泵的流速来调节聚焦后蛋白质推出的速度。
2、 结果与讨论
2、1聚焦及区带迁移条件的选择
    在CIEF中，聚焦时间过长或聚焦电压过高都可能导致聚焦过程中蛋白质样品的沉淀。同时，为了避免在聚焦过程中，毛细管产生过大的焦耳热，本实验最终选择20kv作为最佳聚焦电压。
    本实验采用微流机械泵为迁移动力，通过调节泵的流速来调节聚焦区带的迁移速率。流速过高会导致迁移速率过快，不利与分离，速率过低则会使扩散严重，也不利于聚焦后区带的检测。 通过实验，选择流速为0.001ml/min。
2、2接口段毛细管长度的选择
    在实验过程中发现，接口处毛细管过短容易发生漏液及漏电现象，毛细管长度过长，如超过4cm时，则在接口处容易断裂，故选择接口处毛细管长度为2.5~3cm。
2、3分离结果
   在以上条件下，对牛血清白蛋白和血红蛋白的混合样品进行分离，分离结果如图3所示。

图3. 血红蛋白和牛血清白蛋白分离谱图
Fig.3 Electropherogram of the mixture of hemoglobin and BSA separated by CIEF
Column for CIEF: 100μm(i.d.) ×105cm; voltage: 20kv/20s. Hemoglobin (6μg/mL) and BSA (7.5μg/mL) mixture; catholyte for CIEF: 20mmol/L NaOH; anolyte for CIEF: 20mmol/L H3PO4; buffer: 20mmol PBS pH=7.0, detection wavelength: 254nm. Peaks: 1. Hemoglobin, 2. BSA.

图4. 血红蛋白和牛血清白蛋白分离谱图
Fig.4 The elctropherogram demonstrates the separation results of runs 1(a) and 6(b). Conditions are the same as given in Fig.3.

2、4方法的重现性
    图4为第1次和第6次，对Hb和BSA混合蛋白进行聚焦后的分离谱图。由此可见，在微流泵驱动的条件下，固定化pH梯度毛细管进行等电聚焦可以保证较好的分离效果。
3、结论
    通过采用化学键合的方法，将两性电解质固定在毛细管壁，形成固定化的pH梯度，实现了混合蛋白的分离。由于聚焦时不用再向缓冲溶液中添加两性电解质，故可以自由的选择所需要的最大吸收波长，得到较高的灵敏度。采用聚丙烯酰胺涂层毛细管与CAs固定毛细管的偶联，不仅可以避免碱性蛋白的吸附，而且还可以使得等电点在pH3~10的蛋白质能有效的被检测到，拓宽了有效检测范围。这种新型固定化pH梯度毛细管等电聚焦的方法不仅可以应用在蛋白质的分离，而且在蛋白质样品的富集、多维毛细管电泳以及与质谱的连用技术等领域也将有较好的应用前景。

参考文献
[1]傅若农. 色谱分析概论. 北京：化学工业出版社, 1999
[2]Hjerten S., Zhu M D. J Chromatogr, 1985; 346: 265
[3]Mazzeo J R., Krull I. S. Anal. Chem. 1991,63: 2852
[4] S. Martinovic, L. Pasa-Tolic, C. Masselon, P.K. Jensen, C.L. Stone, R.D. Smith, Electrophoresis 2000 (21): 2368
[5]Pandey A. Mann M. Proteomics to study genes and genomes, 2000, 405 (6788) : 837~846
[6]Rosamond L. , Allsop A., Harnessing the Power of the Genome in the Searchi for New Antibiotics. Science, 2000, 287 (5460): 1973~1976
[7]K. Shimura, Z. Wang, H. Matsumoto, K.I. Kasai, Electrophoresis 2000 (21) : 603
[8]Deepa Mohan, Cheng S. Lee. J. Chromatogr. A 2002, 979: 271-276
[9]Hechun Liu, Chun Yang, Qing Yang, etal. J Chromatogr. B 2005, 817: 119-126.
[10]Rilbe H. Steady-state rheoelectrolysis J. Chromatogr. 1978, 159: 193-205.
[11]Huang T., Wu X.-Z., Pawliszyn J. Anal. Chem. 2000, 72: 4758-4761.
[12]Lochmuller C. H., Breiner S. J. J Chromatogr. 1989,480: 293-300.
[13]康经武, 陆豪杰，梁冰，等. 交联键合型聚丙烯酰胺毛细管电泳涂层柱的快速制备及评价 [J].分析化学，2000,28 (10): 1189-1193

A New Method of Immobilized pH gradient of CIEF Used in Protein Separation

Abstract: A new immobilized pH gradient method was developed for proteins separation by two-step capillary isoelectric focusing based on chemical bonding. A microfluidic pump was used to migrate the focused zones in the capillary. A test sample containing a protein mixture of hemoglobin (Hb) and bovine serum albumin (BSA) was separated by using this method.
Keywords: Capillary isoelectric focusing; Immobilized pH gradient; Protein separation; Chemical bonding;