新型聚合物整体柱微萃取与液相色谱-电喷雾质谱联用测定蜂蜜，鸡蛋和牛奶中的氯霉素残留
黄京芳 张慧娟 施治国 冯钰锜
(武汉大学化学与分子科学学院，武汉430072)

    氯霉素是一种广谱抗生素，曾广泛应用于人类和动物感染性疾病的治疗。由于它有毒性大，抑制骨髓造血系统，引起再生障碍性贫血等副作用，氯霉素在动物源性食物中的残留对人类健康构成巨大的潜在威胁。因此美国及欧盟均禁止在奶牛及产蛋禽中使用氯霉素，任何食品中不得检出。我国也明确规定禁止使用氯霉素。近几年，由于氯霉素残留超标导致人类食用中毒事件引发的贸易争端，进一步引起人们对动物源性食品中氯霉素残留检测的关注。目前，常采用GC-ECD，GC-MS，或HPLC-DAD [1,2,3]等方法测定动物源性食品中氯霉素残留。这些方法需要衍生而变得繁琐，有的不够灵敏。这里，我们采用原位聚合的聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）毛细管整体柱微萃取方法对蜂蜜,鸡蛋和牛奶中的氯霉素进行预处理,优化了pH，萃取容量，解析溶剂及体积等萃取参数，最后采用液相色谱-电喷雾质谱联用建立了简便]、可靠而又灵敏地定量分析蜂蜜，鸡蛋和牛奶中的氯霉素残留的方法。同时对市售的七种品牌的蜂蜜，十个不同来源的鸡蛋，八种品牌的牛奶样品进行了检测。
实验部分
1.聚合物整体柱微萃取
    毛细管整体萃取柱的制备方法详见参考文献[4]，萃取装置及步骤见图一，首先用一定量的甲醇，以0.05mL/min的速度活化萃取柱，然后用1mL的磷酸
    盐缓冲溶液（20mM，pH4）,以0.15mL/min的速度平衡萃取头，避免基质的干扰；上样2ml结束后，用空气将残留的样品推出；最后用0.05mL的60%甲醇以0.05mL/min的速度进行解析，解析液加水稀释至0.1ml进行色谱分析。

2.仪器及液质联用条件
    Waters Micromass2000 液质联用仪。色谱柱：Xterra C18（waters 1mm×3.5μm×15cm）;流动相梯度为：0min：30％甲醇 －70％水 ，5min：70％甲醇 －30％水，8min：70％甲醇 －30％水，15min： 30％甲醇 －70％水。流速 0.2mL/min.质谱条件:电喷雾-负离子源模式，锥孔电压25ev测321/323m/e，30ev测354m/e，45ev测152m/e。
3.样品处理
    1g蜂蜜加pH 2磷酸盐缓冲溶液（1：5）稀释；1g均质化的鸡蛋加pH 4磷酸盐缓冲溶液（1：10）稀释；1ml牛奶加0.4ml甲醇混匀，静置5min，再加pH 4磷酸盐缓冲溶液（1：10）稀释。随后均采用涡旋混匀，静置，离心（12000rpm 10℃）5min，取上清液过0.22μm滤膜过滤后，进行毛细管整体柱微萃取，所得解析液供检测
结果与讨论：
1.固相微萃取条件的优化：
    在一定萃取条件下，考察浓度为25ng/ml的氯霉素水溶液上样0.5~4ml,从图中可看出仍未达到萃取饱和，说明聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）毛细管整体柱对氯霉素有很好的富集效果。此外，还优化了萃取速度、解析流速、萃取基质pH及解析液。

2. HPLC-MS方法确证
    为评价该方法的选择性，我们通过空白实验确证了在蜂蜜，牛奶及鸡蛋的阴性样品中的杂质不干扰测定（图2）。通过对线形，准确性，检测限及定量限的考察，证实了该法对于定量分析蜂蜜三种基质中氯霉素残留的可行性。线性方程及检测限结果见表1以信噪比等于3测得氯霉素在蜂蜜、牛奶和鸡蛋中检测限分别为0.02、0.04、0.04ppb。在高中低三种添加氯霉素对照品的浓度下，分别测氯霉素在三种基质中的回收率在85.2~102.3%范围，日内、日间精密度结果RSD为2.1~8.9%。

     按照上述方法对市售的七种品牌蜂蜜、八种品牌牛奶和十个不同来源鸡蛋进行测定，结果有两个品牌蜂蜜中氯霉素残留高达0.22ppb和0.12ppb,超过国际检测标准0.1ppb规定限度，另有三个品牌的蜂蜜均检出氯霉素，但小于定量限。两个来源鸡蛋和两种品牌牛奶检出氯霉素残留大于检测限小于定量限。
结论：本文采用的聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）的整体柱微萃取技术能简化样品预处理步骤，显示对生物基质良好的相容性，和对被测物良好的选择富集效果。采用液质联用进行样品的分离检测省却了衍生等带来的繁琐操作及测定的误差，提供了灵敏简便的检测方式。将这种新型微萃取技术与液相色谱-电喷雾质谱联用，建立了一种简便有效的测定蜂蜜、牛奶及鸡蛋中氯霉素的残留方法。
参考文献
[1] M. Hmayoun Akhtar, Claude Danies, Andre Sauve,Carla Barry J.Chromatogr A 696(1995) 123-130
[2] L.santos, J.Barbosa, M.C. Castilho , F. Ramos, C.A.F. Ribeiro, M.I.N. da Silveira Anal Chim Acta 529(2005) 249-256
[3] S.Y. Ding, J.Z. Shen, S.X. Zhang , H.Y. Jiang, Z.W. Sun J AOAC Int 88(2005) 57-60
[4] M. Zhang, W. Fang, Y.F. Zhang, J. Nie, Y.Q. Feng, J. Chromatogr. A 1102 (2006) 5294.