柱前衍生化毛细管电泳法分析手性药物2-HPA的研究
杨林 刘伟 戴荣继 邓玉林×
（北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081）

摘要：采用丹磺酰氯柱前衍生，首次对治疗神经退行性疾病的新型手性药物2-HPA建立了毛细管电泳的拆分方法，并对其合成前体2-HA及副产物2-HPPA两种外消旋体的拆分进行了研究。电泳条件：背景电解质为20mmol/L PBS含有10mmol/Lβ-环糊精，PH=4.34；样品的浓度0.1g/L；温度：15℃；检测电压：10KV；进样电压：5KV×5s。
关键词：丹磺酰氯；柱前衍生；手性拆分；毛细管电泳；2-HPA

    手性药物的分离分析是目前分析化学研究的热点和难点,目前主要采用薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)等方法。HPLC是被公认为最有效的手性分析方法,并已在手性药物分析中得到成功应用[1]。CE是高效、快速、微量的新分离分析方法。与HPLC相比,CE在手性分析中具有分离效率高、可直接分离大部分对映体、适用范围广、运行成本低等优点[2,3]。
    2-HPA（N-(2-heptyl)propargylamine）是目前我们研究的用于治疗神经退行性疾病的一种新型药物，主要应用于治疗帕金森（PD）和肌萎缩性侧索硬化（ASL）疾病的开发研究[4]。本实验采用丹磺酰氯柱前衍生化毛细管电泳进行拆分2-HPA和2-HA，2-HPPA直接用毛细管电泳进行拆分，首次建立了三种外消旋体毛细管电泳的拆分方法。
以下是三种化合物的结构式。

1 实验
1.1 仪器和试剂
    Trisep2100毛细管电泳仪, 2-HPA-Dns、2-HA-Dns和2-HPPA均为实验室自制,β-环糊精（广东郁南县环糊精厂），丹磺酰氯（ALDRICH公司），其余试剂均为分析纯。
1.2 衍生化
    用微量取液枪先后吸取1mL2-HPA试样、1mL一定浓度的丹磺酰氯、15mLpH =11.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液于15mL塑料离心管中，在涡流混合器上混匀1min 后置于60℃水浴锅中衍生15min，冷却至室温。离心管中加入3mL乙酸乙酯, 涡流混合器上混匀1min后于4000r/min离心5min后取出,收集上层含有2-HPA衍生物的有机相(乙酸乙酯)，下层水相再加入3mL乙酸乙酯重复萃取2 次。合并3 次萃取的有机相于40℃水浴条件下用氮气吹干。(2-HA按照此方法衍生)。
1.3 电泳条件
    毛细管：未涂渍熔融石英毛细管(河北永年光学纤维厂),50μm×70cm(有效长度40cm)；背景电解质溶液：20mmol/L PBS含有10mmol/Lβ-环糊精，PH=4.34；温度：15℃；检测电压：10KV；进样电压：5KV×5s；检测波长:210nm和254nm。进样前的冲洗条件:先用0.1mol/LNaOH冲洗10min，然后用三蒸水冲洗10min，运行缓冲液冲洗10min；样品的浓度0.1g/L。实验中所用样品及流动相使用前用0.45ｕm的微孔滤膜过滤，并超声30min除气。
2 结果与讨论
2.1 柱前衍生化条件的选择
    2-HPA的紫外吸收很弱、2-HA没有紫外发色基团，但是丹磺酰氯可以同其N的活泼氢发生反应，脱掉一分子HCl生成具有紫外吸收的衍生物，经检测所生成的衍生物在254nm有最大吸收，2-HPPA在210nm有最大吸收。在这反应过程中，经过研究得出较佳的衍生化条件：丹磺酰氯的浓度为9mg/ml、反应温度为60℃、反应时间为15min、缓冲液体系的PH值为11.0。
2.2 缓冲液pH对分离效果的影响
    缓冲液的pH值对手性添加剂的带电性质，带电量，电渗流的大小以及被分离样品的质子化程度等均影响很大。实验证明，在低pH条件下,电渗流迁移速度减缓,对映体向阴极移动的迁移速率减小,从而增强了环糊精与对映体之间的手性识别作用时间,有利于对映异构体的分离。由于电渗流的迁移速度随着pH的升高而加快,使被分离药物与手性添加剂在毛细管柱的迁移时间缩短,较高的pH值反而不利于对映异构体的分离。我们确定最佳分离pH值为4.34。
2.3 手性选择剂浓度对分离效果的影响
    根据Stephen等[5]提出的毛细管电泳手性分离模型,有如下公式:
△μ={[C]( μ1-μ2)(K2-K1)}/{1+[c](K1+K2)+K1K2[C]}其中, △μ为两异构体淌度之差,[C]为环糊精浓度,K1，K2分别为两对映体与环糊精结合的平衡常数。根据此式应有一个使△μ达到最大的环糊精浓度值,该峰值浓度即为最佳手性选择剂浓度。为此,我们考察了β-CD浓度为0-20mmol/L的缓冲溶液对分离效果的影响。实验证实,在10mmol/L浓度下,分离效果较好。

图1 2-HA-Dns的毛细管电泳分离谱图 图2 2-HPA-Dns的毛细管电泳分离谱图

3 结论
    本文首次通过柱前衍生毛细管电泳法对2-HPA及其合成前体2-HA及副产物2-HPPA进行手性拆分，对手性添加剂，缓冲剂PH值和手性添加剂的浓度等条件进行了探讨，最后确定电泳条件：背景电解质为：20mmol/L PBS含有10mmol/Lβ-环糊精，PH=4.34，样品的浓度0.1g/L，温度：15℃，检测电压：10KV，进样电压：5KV×5s。
参考文献
[1] Blomberg LG, Wang H. Determination of enantiomeric excess by capillary electrophoresis[J].Electrophoresis,2000,21(10): 1940-1952.
[2] Eugene CR, Ronald JB. Optimization of a capillary electrophoresis method to determine the chiral purity of a drug[J].JChromatogrA,1994,680(2):609-621.
[3] Changyu Q, Morteza GK. Extending the scope of chiral separation of basic ompounds by cyclodextrin mediated capillary zone electrophoresis [J].J Chromatogr A, 1995,692(1-2):253-265.
[4] David A，Durden, Lillian E，Dyck Drug Metabolism and Disposition 2000，28(2):147-154.
[5] Wren SAC,Rowe RC.Theoretical aspects of chiral separation in capillary electrophoresis [J].J Chromatogr,1992,603:235.

Study of separate chiral drug 2-HPA by pre-column derivation Capillary Electrophoresis
Yang Lin, Liu Wei , Rongji Dai, Yulin Deng
(School of Life Science and Technology, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081)

Abstract: In order to resolution the chiral drug 2-HPA by Capillary Electrophoresis, dansyl chloride was chosen as the reagent for pre-column derivation to give 2-HPA derivatives. The precursor 2-HA and outgrowth 2-HPPA have also been separated. A suitable chiral resolution conditions studied in the Capillary Electrophoresis was presented: 10mmol/L β-cyclodextrin (CD) dissolved in 20mmol/L-1 PBS, PH=4.34; samples 0.1g/L; temperature 15℃; separation voltage: 10KV; samples were injected into the capillary by 5kv for 5 seconds.
Keyword: dansylchloride; pre-column derivation; chiral separation; capillary electrophoresis ;2-HPA