中医证侯与代谢组学
邓翀 张静 王妙闻 张艺
（成都中医药大学 610065 四川成都）

       中医学以她那特有的理论思维方式和可靠的治疗效果存在了数千年，但在自然科学和现代医学迅猛发展的今天，有相当多的人用现代医学的思维方式去验证、去阐明中医的经典理论，给中医学带来前所未有的发展机遇。但中医的核心理论“辨证论治”中的“证”始终没有得到科学地阐明。
一、中医证侯及其现代研究
       李致重给证侯的定义是“证侯是中医学的专用术语，即通过望、闻、问、切四诊所获知的疾病过程中表现整体层次上的机体反应状态及其运动变化，简称为证或者证侯。[1]中医认为，人体是以五脏为中心，通过经络系统，把六腑、五体、五官、九窍、四肢百骸等全身组织器官联系起来的有机整体．并通过精、气、血、津液的作用，来完成机体统一的机能活动，机体各个部分在生理上互相联系，在病理上互相影响 不但如此，中医还把人与自然界联系在一起，认为人与天地相参，与日月相应。因此在辨证过程中不但要“见肝之病，知肝传脾”，考虑到人体各部分的互相影响，还要注意“四时之气，更伤五脏”，考虑到人与自然的互相影响。总起来看，中医辨证所运用的四诊是整体诊法，它虽然不能深入到机体内部，却把注意力充分集中在了整体层次生命现象的丰富性和多样性上，对外在病象的探察可谓全面而细致；辨证所运用的思维方式是整体思维，它以二元结构为主体，向多元结构展开，包含着朴素的辩证法和系统思维。证作为整体诊法和整体思维的认识结果，它反映的是人体的总体特征，是一种整体量即状态。证是“个体化医学” 的体现 中医学强调整体观，注重因人、因地、因时不同而治疗方法不同，反映其具体问题具体解决的现实选择思维。治病以人为根本，把人和病密切地结合成一个整体，从人体生命活动的总体上把握个体的差异性。
       总之，中医“证”是从环境、时间及人的差异反映个体化个体的非健康状态。
中医证侯如此复杂，怎样用现代医学来阐述表达与验证呢？
已有相当多的人对此进行了研究。周正等采用免疫组化法、荧光定量PCR法检测粘膜组织中的水通道蛋白4(AQP4)的蛋白表达和信使核糖核酸(mRNA)表达，从水液代谢角度探讨脾胃湿热证的机理， [2] 李炜弘等通过基因表达谱分析冠心病心阳虚证的差异表达基因，探寻心阳虚证的特征性基因表达谱。[3] 施维群等采用流式细胞术和ELISA方法探讨慢性乙型肝炎患者外周血T细胞亚群CD28分子的表达及血清IL-2、IL-10、IL一12和IFN-υ的含量与中医辨证分型之间的相互关系。[4] 罗云坚等采用eDNA芯片技术，探讨脾气虚证免疫功能的异常变化，并揭示其发生的基因组学机制。[5]以上的研究都是从不同侧面对中医证侯的阐述，但都不能表达中以“证”运动变化状态的本质。
二、代谢组学及其特点
       代谢组学是一门快速发展的科学研究领域，代谢组学的概念最早来源于代谢轮廓分析(Metabolic profiling)，它由Devaux等人于上世纪70年代提出。[6]
       l986年，Journal of Chromatographv A 出版了一期关于Metabolic profiling的专辑。[7]到90年代后期，随着基因组学的提出和迅速发展，Oliver于1997年提出了代谢组学(metabolomics)的概念[8]是系统生物学(System biology)的重要组成部分。
       生命是一个完整的系统，在复杂的生物体中，生物分子组织和调控水平是相互关联的、互相依赖的，并受各种各样的生理和环境因素的影响．生物体液中的代谢物与细胞和组织中的代谢物处于动态平衡，生物体中细胞功能异常一定会反映在生物体成分的变化中。所有的由于病理生理紊乱引起的直接化学反应，或通过与控制代谢的酶或核酸相结合而引起的内源生化物质在比例、浓度、代谢通量等方面的失调都会在代谢物成分中得到反应．这种变化有可能是出现新的代谢产物，而更多的情况是各种代谢产物之间的相对浓度发生细微而特征的变化。通过高灵敏的方法例如NMR、HPLC-MS、GC-MS检测代谢物的化学成分，并使用各种化学计量学和生物信息学工具研究代谢物，就是代谢组学。
      代谢组学研究的是生命个体对外界干扰(药物、或饮食等)的刺激、环境变化或遗传修饰所做出的所有代谢应答的全貌和动态变化过程，对生物体液和组织进行系统测量和分析，对完整的生物体(而不是单个细胞)中随时间改变的代谢物进行动态跟踪检测、定量和分类，然后将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来，从而确定发生这些变化的靶器官和作用位点，进而确定相关的生物标志物。[9-10]而且通过研究整个生物体代谢依赖的参数，测量对时间响应的代谢物变化，还可以研究遗传学上的差异导致的代谢谱变化,不同物种由于其对饮食和生长环境的代谢适应性不同，其尿液中的代谢产物组成也是不同的．[11]例如，Holmes等通过对这两种大鼠的尿样的NMR谱图采用概率神经网络的模式识别方法，能够清楚地分辨出它们的代谢谱特征．[12]野生型和经过遗传修饰的用来作为疾病模型的动物之间的差异[13] ，饮食和肠道菌群的影响[14]，昼夜变化、激素的周期变化等因素都会在代谢物谱中得到反映[15]，都在代谢组学研究中被区别开来． 
      代谢组学研究具有以下两个明显的特点：1）、整体性。代谢组学能够跟踪机体反映整体状态，可充分地对机体的健康、亚健康、病理状态作出准确地评价。2）、连续性。它研究的内容是机体一切生理活动新陈代谢的终端，根据机体的代谢物情况，可以对机体连续时间段的健康状态作出评价。
三、基于代谢组学探讨中医证侯的表达
      代谢组学认识生物的观点是从局部观走向整体观，从线性思维走向复杂性思维。中医药学本来就是先进的系统生命科学认知体系，“证”的研究正好可以和这个处于科学前沿、综合程度很强的系统生物学理论相结合，同时也是生命科学和临床医学相结合，这将是后基因组时代最重要的研究方向之一，从而把“证”的研究再次推向科学发展的前沿。
      代谢组学的整体研究思路与中医药的“整体观念”是相吻合的，中医药研究中引入代谢组学，必将能够更准确阐明中医药理论的科学内涵。以代谢组学的研究方法研究中医证侯，可以表达证侯状态这一变量，能够反映环境、社会、心理、饮食对机体的影响，以机体微观的内源代谢物的微小变化，代谢通道关或开，反映机体宏观“证”的表达。因此，以代谢组学为技术支撑，可以较为准确地对中医证侯作出表达，及其其运动变化的本质。
      以代谢组学为支撑，研究中医证侯的研究方法和思路做出设计，希望为能科学阐明中医征候，以中医征候研究的热点问题“肾虚证”为例，阐明我们的研究思路：
（1）“肾虚证”的 研究坚持以“临床为出发点，从临床到实验，再从实验回到临床中”的原则，“肾虚证”病例纳入以临床诊断为主，并结合临床生化指标检测。
（2）利用色谱/质谱联用（GC/MS、LC/MS/MS）、核磁共振（NMR）指纹谱等现代分析技术，比较研究正常组、疾病组（阳虚证和阴虚证）的代谢产物差异谱，建立肾虚证的代谢产物指纹图谱数据库。
（3）应用PCA、ANN等模式识别计算机技术可编制软件用于肾虚证诊断分型，另一方面通过关联规则发现等数据挖掘技术和因果发现方法等信息处理技术，辨识不同证侯类型代谢指纹图谱中的特征成分，对关键代谢产物进一步分离、鉴定，发现某些辅助诊断分型的生物标志物。
（4）根据代谢产物指纹图谱、机体内物质的代谢途径、肾虚证相关证侯类型的病变过程、整体指标和组织层面指标和代谢组学的内源代谢物的生物标记物的相关性，从代谢组学角度阐明“肾虚证”的发生、发展及变化的规律。
（5）最后从临床诊断标准、内源代谢物及代谢通道的变化规律，揭示“肾虚证”的本质。
四、小结与展望
      对于中医证侯研究，笔者认为以中医理论为指导，以代谢组学为支撑，以现代色谱光谱技术等及模式识别计算机技术为研究手段，可以阐明证侯状态的本质。
参考文献
[1]崔月犁等．中医沉思录(一)．北京．第一版．中医古籍出版社，1997：188。
[2] 周正,劳绍贤, 黄志新等. 从水通道蛋白4的表达探讨脾胃湿热证的机理，广州中医药大学学报，20O4,21(5):369-372.
[3]李炜弘，王米渠，王刚等. 冠心病心阳虚证相关差异表达基因分析.现代中西医结合杂志，2004，13(24)：3219-3222.
[4]施维群，缪锡民，黄茵等. 慢性乙型肝炎患者外周血T细胞标记物表达及细胞因子水平与中医分型的关系，世界华人消化杂志，2005，13（11）：1364-1367.
[5]罗云坚，修宗昌，黄穗平等.脾气虚证免疫相关基因组学机制初探，中目中两医结合杂志，2005，25（4）：311-314.
[6] Devaux PG，Homing MG，Homing EC．Benyzl—oxime derivative of steroids：a new metabolic profile procedure for human urinary ste—roids Ariaf Lett，l97l，4：l5l
[7] Elsevier．J Chromatogr．A．1986，379.
[8]Oliver S．Yeast as a navigational aid in genome analysis．Microbiology，
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[9] Nicholson L K，Lindon J C，Holmes E． Metabonomics'：understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]．Xenobiotica，1999．29(2): 1181-1 189．
[10]Nicholson J K，Connelly J，Lindon J C，et a1．Metabonomics：a platform for studying drug toxicity and gene function[J]．Nat Rev Drug Disc，2002，1(2)：153—161．
[11] Gavaghan CL，Holmes E，Lenz E，et a1．An NMR-based metabonomics approach to investigate the biochemical consequences of genetic strain differences；application to the C57BL10J and Alpk：Apfcd mouse[J]．FEBS Lett，2000，484(10)：169-174．
[12] Holmes E，Nicholson J K，Tranter G．Metabonomic characterization of genetic variations in toxicological and metabolic responses using probabilistic neural networks[J]．Chem Res Toxico1．2001，14(2)l 182—191．
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