新型近红外荧光探针MeCy5-OSu衍生
毛细管电泳分离激光诱导荧光检测磷酸化氨基酸

傅妮娜，王红，张华山
(武汉大学化学与分子科学学院，武汉，430072，hszhang@whu.edu.cn)

       蛋白质磷酸化作用是通过对蛋白质上的氨基酸进行磷酸盐的酯化作用来改变蛋白质的构象，进而影响蛋白的活性和稳定性。蛋白磷酸化的作用与功能研究日渐成为细胞生物学和生物医药科学的焦点。它在以蛋白质为基础的生命过程中起着关键的调节作用。这些过程包括：细胞的分化和繁殖、基因表达以及一系列的代谢过程[1-4]。在真核细胞中，最典型的磷酸化作用的接受体为含羟基的氨基酸，而常见的含羟基的氨基酸主要有丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）和苏氨酸(Thr)。因此，测定磷酸化蛋白质和磷酸化氨基酸对深入了解和研究细胞生物学和生物医学具有十分重要的意义。目前测定蛋白质磷酸化传统方法是放射性同位素32P示踪法，但此方法有放射性的危害。毛细管电泳由于具有高效、快速、样品量少等优点，成为近几年来广泛使用的一种分离手段。用毛细管电泳分离紫外可见方法检测磷酸化氨基酸也有报导，但灵敏度较低，所需的蛋白样品量较大，给那些蛋白量少或难于提纯的蛋白质的分析带来不便。激光诱导荧光检测（LIF）是毛细管电泳所有检测方法中最灵敏度的检测方法之一，检测限可达1013mol L-1。因此，用荧光探针标记磷酸化氨基酸、毛细管电泳分离、激光诱导荧光检测可用于测定微量级样品中痕量磷酸化氨基酸的目的。
       1–（ε–琥珀酰亚胺羧戊基）–1'–甲基–3，3，3'，3'–四甲基吲哚碳菁–5，5'–二磺酸单钾盐（MeCy5-OSu），是我们实验室新合成的一种近红外荧光探针，它以五次甲川花菁为荧光团，以N-琥珀酰亚胺酯为活性基团，能在低浓度下快速、温和地衍生氨基化合物。其激发和发射波长分别为649 nm和667 nm，在这个光谱区，生物样品基体和一些化学杂质的光吸收或荧光强度很小，因而背景干扰也大大降低。除此之外，它还具有水溶性好，能与635 nm的激光器相匹配等优点，非常适合测定细胞中的某些痕量胺类化合物。它的结构见图1。

       在该实验中，我们研究了以MeCy5-OSu作为衍生试剂毛细管电泳激光诱导荧光检测磷酸化氨基酸。衍生条件：试剂用量1.3×10－5 mol L-1；缓冲溶液pH 8.8；反应时间和温度分别为20 min和25 oC，磷酸化氨基酸的浓度1.0×10－6 mol L-1。分离条件：背景电解质为10 mmol L-1磷酸和60 mmol L-1SDS，pH=4；分离电压22.5 kV，反向加压进行电泳；所用毛细管为聚丙烯酰胺涂层毛细管。三个磷酸化氨基酸在7min内达到完全分离。
      该方法具有灵敏、快速、操作方便等优点，将之用于样品中的磷酸化氨基酸的分离测定正在进一步的探讨中。

图2. 磷酸化氨基酸的毛细管电泳分离图

关键词：1–（ε–琥珀酰亚胺羧戊基）–1'–甲基–3，3，3'，3'–四甲基吲哚碳菁–5，5'–二磺酸单钾盐（MeCy5-OSu）；磷酸化氨基酸；衍生；毛细管电泳；激光诱导荧光检测
参考文献：
1. Cantrell D., Annu. Rev. Immunol., 1996, 14: 259－274.
2. Lau A.F., Kurata W.E., Kanemitsu M.Y., J. Bioenerg. Biomembr., 1996, 28: 359－368.
3. Sjaastad M.D., Nelson W.J., Bioessays, 1997, 19: 47－52.
4. Hunter T., Cell, 2000, 100: 113－127.

Analytical potential of 1-(ε-succinimydyl-hexanoate)-1'-methyl-3,3,3',3'- tetramethyl-
indocarbocyanine-5,5'-disulfonate potassium for the determination of phosphoamino acid by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection

Nina Fu, Hong Wang, Hua-Shan Zhang

通信地址和联系人：武汉大学化学与分子科学学院分析科学中心 张华山教授
联系电话：027-87218924
E-mail：hszhang@whu.edu.cn