肌酸对3T3表皮细胞的毒性研究
王琳，王坤，肖盛元，邓玉林*
（北京理工大学 生命科学与技术学院，北京100081）

      肌酸是一种普遍流行的能量增强剂。人们一直认为肌酸是安全有效的，但最近有报道指出，怀疑个别举重摔跤运动员的猝死与其长期大量服用肌酸有关，认为短期服用肌酸不会影响健康，但长期大量服用会对生物体造成一定的毒性伤害。本实验将不同剂量的肌酸与3T3表皮细胞供培养，然后用MTT法测细胞存活率，同时用HPLC/MS的方法测细胞内外液中SSAO的活性。结果表明肌酸可以升高3T3表皮细胞内外液的SSAO活性，并降低细胞存活率，从细胞水平上论证了肌酸的毒性伤害。

1 实验部分
1.1 试剂和仪器
      纯肌酸粉购自康比特威创体育新技术发展有限公司。多巴胺购自Fluka 公司。乙腈为色谱纯，购自Fisher公司。其他试剂为分析纯。仪器为Agilent 1100 LC MSD Trap MS。
1.2 细胞培养
      3T3表皮细胞在DMEM + FBS (10%)培养基中于37 ℃培养，每隔两天换液一次。加入不同浓度肌酸培养后取培养基做为细胞外液，将挂壁细胞超声破碎后，17000 g离心10 min，取上清做为细胞内液。
1.3 LC/MS测细胞内外液SSAO活性
      标准甲醛溶液中加入40 mg多巴胺，在400μl的0.05 M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中，37℃反应30分钟，PCA终止反应。9mg异丙基肾上腺素做为内标，终体积为500μl 。体外细胞液反应体系为：25mM 甲胺、60μl细胞液、10mM 多巴胺。终止反应后在4℃下17000 g离心10 min，取上清液过滤进样。
色谱条件：Discovery F5-SH柱 4.6 mm×250 mm，5μm，10％（v/v）乙腈/缓冲盐的流动相（pH 4.0），流速0.8 ml/min，进样量20 μL 。
质谱条件：检测器为MS，ESI源，正离子模式，一级质谱做全扫描，扫描范围160～220 m/z，提取m/z 170的离子流色谱图。雾化气压力为30psi ，干燥气流速为9 L/min 。
1.4 MTT法测细胞存活率
      挑选处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化后离心，制成细胞悬液，浓度为2.5X105个/ml。将细胞加入96孔板培养24小时后加入不同浓度的肌酸容易，继续培养。加入MTT（0.5mg/ml）37 ℃反应4小时，吸出孔内全部液体，加入DMSO溶液震荡10min，以酶标仪测定其吸光度，波长为570nm。
2 实验结果
      由图1可知，随着肌酸浓度的增加， 3T3表皮细胞内外液SSAO活性均有所升高，其中细胞内液中SSAO活性明显高于外液。MTT结果表明（见图2）肌酸与细胞培养4小时后，1.25mg/ml肌酸可使细胞存活率降为88.99％，培养24小时后，1.25mg/ml肌酸可使细胞存活率降为73.04％ 。
3 讨论
      实验结果表明，肌酸有可能造成3T3表皮细胞内的SSAO活性升高，而SSAO活性的升高又可能引起一系列与之相关的并发症，对细胞造成一定的毒性伤害。同时，肌酸在很大程度上影响细胞的存活，这也可能是其会造成毒性伤害的原因之一。在下一步的实验中，我们将选取有效浓度的肌酸与细胞培养，并测其细胞凋亡率，更全面的对肌酸的细胞毒性进行论证。
 

Investigation of potential cytotoxicity of creatine in 3T3 serwis
Lin Wang , Kun Wang, Shengyuan Xiao , Yulin Deng *
a Beijing Institute of Technology, 5 Zhongguancun South Street, Haidian District, Beijing, 100081, China

Abstract. Creatine is alleged to be an ergogenic acid to enhance sports performance. Although short-term supplementation of creatine has not been associated with major health risks, the safety of prolonged use has caused some concern. In this study, we demonstrated the SSAO activity in cells treated by creatine using HPLC/MS method, and analysis the survival rate of cells using MTT method. The results suggest that creatine as a nutrition supplement would be potentially cytotoxic.
Keywords: creatine, SSAO, cytotoxicity, HPLC, MS