在线甲基衍生化气相色谱法测定生物发酵液中大观霉素
王丽丽1*、王益萍2、张晓1、裘娟萍3
浙江工业大学化学工程与材料学院1，药学院2，生物工程研究所3
杭州，310014

摘要 本文采用在线甲基衍生化气相色谱法测定生物发酵液中大观霉素。 讨论了进样口温度、衍生化试剂的种类及衍生化试剂的添加量对测定的影响，优化了在线甲基衍生化的色谱条件。大观霉素标准水溶液的浓度在0.1 g/L - 50 g/L浓度范围内，线性良好，线性相关系数为0.9998。当浓度为0.1 g/L 时，测得其R.S.D.（%）为1.04 %（n=3）。方法的最低检出限为0.01g/L。本方法初步应用于实际生物发酵液中大观霉素的测定,结果满意。
关键词 大观霉素，在线甲基衍生化气相色谱法，TMAH醇溶液，发酵液

   大观霉素（spectinomycin）是一类广泛运用于临床的氨基环醇类抗生素，具有较强的抗菌作用，是兽医用药的首选品种之一。目前对于大观霉素的测定，主要有生物法测定其效价[1]、萃取光度法[2]、高效毛细管电泳法（HPCE）[3]、高效液相色谱-紫外检测法（HPLC/UV）[4]、高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC/ELSD）[5,6]、离子对高效液相色谱电化学检测[7]以及气相色谱（GC）[8,9]等方法。其中，生物法测定效价，方法烦琐、费时，且准确性较差；萃取光度法操作虽然简单，但特异性不强，测定误差较大；HPCE所得结果与生物效价法得到的结果存在较大的误差，因此没有被广泛的认可；GC和HPLC/UV需要进行柱前或柱后衍生化，步骤烦琐；HPLC/ELSD则在定量上存在一定的缺陷。 近来，作者已成功地将热辅助下的在线甲基衍生化气相色谱法应用于生物发酵液中二羟基丙酮与甘油的同时测定[10]，甲基衍生化试剂为四甲基氢氧化胺（tetramethylammonium hydroxide, TMAH）。因此本文引入该法来研究对大观霉素的测定。热辅助下的在线甲基衍生化气相色谱法简单、快速、重现性好，并且有较低的检测限，可望作为实际生物发酵液中大观霉素测定的有效方法。

1 实验部分
1.1 仪器及色谱条件
   美国瓦里安公司CP-3800气相色谱仪，氢火焰离子化检测器(FID)，日本Frontier公司的ULtra ALLOY-5不锈钢金属毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm i.d. ×0.25 µm 膜厚），载气为高纯N2，柱流量1 mL/min，分流比为50：1，柱温为50 °C-280 °C （20 °C /min，保持5min），检测器温度为280 °C 。Tetramethylammonium hydroxide (TMAH，25%，v/v)水溶液、TMAH（25%，v/v）醇溶液、Trimethylsulfonium hydroxide（TMSH，25%，v/v）醇溶液购于上海百灵威化学技术有限公司。
1.2 样品配制
   大观霉素标准溶液的配置：准确称取大观霉素1 g于烧杯中，加适量的蒸馏水使充分溶解，并转移至10 mL的容量瓶中，定容，配置成100 g/L的大观霉素；再用蒸馏水稀释成不同浓度的标准溶液，待用。
   优化条件时大观霉素样品的配置：取50 L 浓度为30 g/L大观霉素标准溶液于1 mL瓶中，并加入50 L 甲基衍生化试剂溶液，混合均匀，此时样品: 衍生化试剂的体积比为1:1。
1.3 生物发酵液样品
   由本校生物工程研究所提供。
2 结果与讨论
2.1 TMAH在线甲基衍生化的效果
   图1为300 °C时0.6 µL的30 g/L的大观霉素水溶液的气相色谱图（a）未添加TMAH，（b）添加TMAH（样品:TMAH（25%，v/v）醇溶液的体积比为1:1）。由于大观霉素的极性较强，直接进行GC分析时，在色谱图(a)上没有观察到相应的色谱峰。与此相反，在加入TMAH后得到的色谱图（b）上，在12.7 min明显观察到大观霉素与TMAH反应后形成的甲基化衍生物的峰，且峰形尖锐，响应值高。结果表明可以采用在线甲基衍生化气相色谱法测定大观霉素。
2.2 在线甲基衍生化试剂的选择
   本实验主要选择了TMAH醇溶液，TMAH水溶液和TMSH醇溶液三种甲基衍生化试剂进行反应。图2是大观霉素在300°C下分别与以上三种甲基衍生化试剂（样品: 衍生化试剂的体积比为1:1）反应的谱图。在添加TMSH的条件下，在12.7 min左右没有观察到相应的甲基化大观霉素的色谱峰，因此TMSH在该条件下无法使样品甲基化；而添加了TMAH醇溶液与TMAH水溶液的色谱图上均在12.7 min观察到较强的色谱峰，且峰强度相近，因此可以说明这两种甲基衍生化试剂的效果接近。但考虑到实验是采用FID作为检测器, 为了避免大量的水溶液的带入, 本实验采用TMAH醇溶液作为甲基衍生化试剂。
2.3 进样口温度选择
   选择适当的进样口温度，对大观霉素是否达到完全反应并提高分析的灵敏度起着至关重要的作用。本实验在所给的色谱条件下，对浓度为30 g/L的大观霉素水溶液添加TMAH醇溶液的样品（样品: TMAH的体积比为1:1）进行测定，选择了200°C、220°C、250°C、300°C及 400°C来考察温度对衍生化效果的影响。结果表明，当温度从200°C升高至300°C时，大观霉素的甲基化衍生物的峰强度也随之升高，表明在低于300°C时反应尚不完全。而当温度到达300°C以上时，峰强度基本不变，并趋于平衡。这说明温度为300°C或高于300°C时，大观霉素的甲基化反应已完全。考虑到仪器进样口的限制，以下实验中的反应温度选择300°C。
2.4 样品与TMAH醇溶液添加量的关系
   为了提高反应的效率，合适的甲基衍生化试剂的添加量，对样品的反应也起着重要的作用。甲基衍生化试剂量不足，会导致反应不够彻底，使结果不够准确，而过多的甲基衍生化试剂会造成试剂的浪费。本实验通过对四个添加不同量的甲基衍生化试剂的样品（用微量注射器取0.3µL浓度为30g/L大观霉素水溶液，后再抽取0.06µL至0.6µL的TMAH试剂）进行分析，所得的甲基衍生物峰面积与甲基衍生化试剂的添加量的关系如图3所示。结果表明，当TMAH添加量从0.06µL增加至0.15µL时，大观霉素的甲基衍生物的峰强度随之增大，而TMAH添加量继续增大时，峰强度基本不再改变。说明0.15µL TMAH（25%，v/v）醇溶液添加量就可以使反应基本达到完全。但该方法在一般操作上需要考虑使TMAH过量，保证反应能充分进行，本实验选择TMAH的添加量为0.3µL，即样品: 衍生化试剂的体积比为1:1，摩尔比为约为1：40。
2.5 方法的线性、重现性与检测限
   通过对在 0.1 - 50 g/L之间五个浓度（0.1、0.5、1、5、50 g/L）的大观霉素水溶液的测定，结果表明在这样一个浓度范围内，该物质在FID上的峰面积响应与进样浓度存在较好的线性关系，并计算得到线性回归方程为y = 14.998x + 258.04，线性相关系数达到0.9998。当大观霉素水溶液的浓度为0.1 g/L 时，测得其相对标准偏差（R.S.D.）为1.04 %（n=3）。以峰信号为噪音信号的三倍为最低检出标准，本方法的最低检出限为0.01 g/L。
2.6 发酵液中的大观霉素的测定
   取50L大观霉素发酵液（黑色）于1mL瓶中，并加入50LTMAH（25% v/v）醇溶液，混合均匀。取此溶液0.6L，按照所选择的色谱条件进行分析。如图4所示，在所选择的色谱条件下，发酵液中各组分都能很好的分离，并可以检测到12.7min大观霉素衍生物的峰（图中以*号标记）。因此以此色谱峰为标准，通过外标法计算得到该发酵液中大观霉素的浓度为2.7g/L。
结论
   初步尝试了在线衍生气相色谱法测定生物发酵液中大观霉素，结果表明该方法操作简单，快速，并有良好的重现性、线性以及检出限，是测定大观霉素的一种有潜力的方法。但是我们还必须再进一步检验本法对实际样品测定时的准确度与精密度，及标准添加的回收率与重现性。还需试验本法测定结果与生物效价法的相关性。

参考文献
[1] 中国药典. 二部, 1995
[2] 亓平言, 冯闻铮, 生　龙, 孙爱英,李志国. 分析科学学报，1997，13（2）:175
[3] 车宝泉, 田南卉, 厉进忠, 陆　岩, 凌大奎. 药物分析杂志, 1998, 18 (4):273
[4] Hamamoto K, Mizuno Y, Koike R, et al., [ J ].Shokuhin Eiseigaku Zasshi ( J Food Hyg Soc Jpn) . 2003, 44(2) : 114.
[5] 吴　燕, 郭成明, 张胜强, 天津药学, 2004, 16(4):4.
[6] 吴　燕, 郭成明, 张胜强, 中国药科大学, 2005 ,36 (1) :40.
[7] Szunyog J, Adams E, Liekens K, et al., [ J ]. J Pharm Biomed Anal, 2002, 29 (1 - 2) : 313.
[8] European Pharmacopeia. 2002, 1:1952~1954
[9] J.Hoebus, Li Ming Yun, J. Hoogmartens, Chromatographia, 1994, 39:71.
[10] Wang Lili, Qian Jie, Hu Zhongce, et.al., [J]. Anal. Chim. Acta, 2006, 557: 262.

etermination of spectinomycin in fermentation broth by on-line pyrolytic methlation/gas-chromatography

LiLi Wang1, Yiping Wang2, Xiao Zhang1, Juanping Qiu3
Zhejiang University of Technology, 1College of Chemical Engineering and Materials Science, 2College of Pharmaceutical Science, 3Institute of bioengineering, Hangzhou, 310014, P.R.C

Abstract A method to determine spectinomycin in fermentation broth was developed on the basis of on-line pyrolytic methylation–gas chromatography (GC). Important factors such as injection temperature, the kind of methylation reagent and the amount of the methylation reagent were investigated in order to obtain the optimum methylation conditions. The achieved calibration curves exhibit good linearity with regression coefficients of 0.9998 at the concentration range from 0.1g/L to 50g/L. The precision was quite high with the R.S.D. 1.04 % for spectinomycin at 0.1 g/L concentration levels, and the limit of detection reached 0.01 g/L. The potential of the proposed method was applied to determination of spectinomycin in fermentation broth. The results proved that this on-line pyrolytic methylation–GC technique was satisfied.
Keywords spectinomycin; on-line pyrolytic methlation/gas-chromatography; TMAH; fermentation broth

*联系人： 王丽丽 (Ph.D)
电话：0571-88320416； 传真：+86-0571-88320103
E-mail 地址: lili_wang@zjut.edu.cn