HPLC/ESI/MS定量检测丹酚酸B
杨嘉明1、肖盛元1、牟晓玲1，2、邓玉林1，*
（1.北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081；
2.中国人民武装警察部队学院工程系，河北廊坊065000）

   丹参是唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎，在中医药临床中常用于增加冠状动脉流量[1]，治疗心绞痛[2]，动脉粥样硬化[3]，肝炎和肝硬化[4]等疾病。丹酚酸B是丹参水溶性部分的主要成分，最近药理研究表明，丹酚酸B除了清除自由基的作用外，还能抗神经毒、保护神经元[5-6]，对心肌缺血 / 再灌注损伤有保护作用[7-8]。
   目前的研究中，对丹酚酸B的高效液相色谱（HPLC）分析测定多采用紫外或荧光检测，而使用高效液相色谱/质谱联用法（HPLC/MS）少见报道。由于生物样品中的丹酚酸B在HPLC检测时不易得到较好的分离，常常需要在流动相中添加多种试剂。有报道[11]采用微柱色谱法检测胆汁中的丹酚酸B，能获得较低的检测限（0.07μM）,但流动相配比复杂，需添加两种有机溶剂及离子对试剂；采用荧光检测丹酚酸B时[12]，检测限低至0.018μM，但荧光强度受流动相背景影响较大[12]，其在生物样品中的检测未见报道。
   本文采用HPLC/ESI/MS定量测定丹酚酸B，利用离子阱的二次分离功能大大提高了方法的选择性，而且流动相组成简单，具有较高的灵敏度（只与荧光检测法相差一个数量级）。对小鼠腹腔注射丹酚酸B后的血浆浓度进行了测定，方法操作简单，数据准确可靠。
1．实验部分
1.1 仪器与材料
  Agilent 1100 series高效液相色谱-SL离子阱质谱联用仪；Millipore纯水仪；Heraeus台式离心机。甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯；丹酚酸B由本实验室制备提供（含量>95％）；ICR小鼠购于北京大学医学部。
1.2 色谱条件
色谱柱：Phenomenex ODS (4.6mm i.d.×250mm, 5um) ；流动相A：1000ppm（w / w）甲酸铵，并含2ppm（w / w）醋酸锌的水溶液，氨水调pH值至7.3。流动相B：甲醇。梯度洗脱程序：0 min 15%B, 20 min 50%B，30min 80%B。流速为0.8 ml / min；柱后分流，分流比4:1。进样体积：60μL。
1.3 质谱条件
质谱条件为：负离子电喷雾离子化方式；目标离子m/z 717；扫描范围为m/z 667～767；多反应监测（multi-reaction monitor, MRM）信号检测模式，母离子m/z 717，分离宽度±5 amu，但不选择碰撞。雾化气压力为28 psi；干燥气流速8 l/min，干燥温度325℃。毛细管电压为4000V。以m/z717离子的提取离子流色谱图对丹酚酸进行定量。
1.4 样品处理
动物处理：雄性ICR小鼠共6只，体重在25—27g，随机分组，饲养笼中喂养4天，给药前12小时禁食。按16mg/kg的剂量向小鼠腹腔注射丹酚酸B水溶液0.25-0.27mL，20min后眼眶取血（肝素钠抗凝），4000rpm离心得血浆，-80℃保存备用。
取室温下解冻的血浆200μl，加入200μl的1M盐酸，漩涡混匀1 min，再加入800μl甲醇沉淀蛋白，17000 g离心10 min。取出上清液0.9 ml，室温下N2吹干后，加入300μl的甲醇溶解。17000 g离心5 min后进样60μL。

2．结果与讨论
2.1 实验参数确定
试验参数优化包括一下三个方面：（1）扫描范围，分别选用一个小的扫描范围m/z 712 ~ 812 (717±5)和一个大的扫描范围m/z 667 ~ 767 (717±50)。（2）数据采集模式，分别选择全扫描模式和MRM模式（MRM信号检测模式，母离子m/z 717，分离宽度±5 amu，但不选择碰撞）。（3）流动组成，水相分别采用在1000ppm（w/w）的甲酸铵溶液以及含1000ppm（w/w）的甲酸铵和2ppm（w/w）醋酸锌的溶液。对上述三种因素进行2个水平的正交试验，丹酚酸B的浓度为5μM，重复3次。对m/z 717的离子的提取离子流色谱图的积分面积和信噪比的平均值进行对比。试验结果如下表1。

注：全扫描1，扫描范围为717±5，信号采集模式为全扫描；全扫描2，扫描范围为717±50，全扫描；MRM 1，扫描范围为717±5，信号采集模式为MRM；MRM 2，扫描范围为717±50，信号采集模式为MRM。
2.1.1 扫描范围对信号的影响
   从表1的实验结果数据中可以看出，扫描范围为717±50时，不论采取全扫描模式还是MRM模式，丹酚酸B的信噪比（112.9, 109.8）均明显优于扫描范围为717±5时的信噪比(27.6, 44.7)。改变流动相的组成时（流动相中加锌离子），大扫描范围下，丹酚酸B的信噪比（131.1，141.5）仍然明显优于小扫描范围下的信噪比（36.5，51.1）。
   一般来说，因为空间电荷效应的影响，离子阱质谱分析实验中，选择较小的扫描范围，可以减少在离子累积过程中其它背景离子的影响，从而减少空间电荷效应，获得更好的信噪比。但在本实验中，选择较小的扫描范围(717±5)，离子的漂移严重，选择一个合适的扫描范围(717±50)可获得更好的信噪比。
2.1.2 信号采集模式对试验结果的影响
   由表1数据可以发现，在小扫描范围下，信号采集模式使用MRM时，丹酚酸B的信噪比（44.7）要优于全扫描模式下的信噪比（27.6），但在大扫描范围下没有显著差异。当在流动相中添加醋酸锌后，无论在小扫描范围还是大扫描范围下，使用MRM模式时的丹酚酸B信噪比（51.1,141.5）均要略优于全扫描模式下的信噪比(36.5,131.1)。由此可见，信号采集模式使用MRM模式可以获得更好的信噪比。
2.1.3 锌离子对丹酚酸信号的影响
   表1的结果表明，在流动相中添加醋酸锌后，在信号采集模式为全扫描时，无论采用小扫描范围(717±5)还是大扫描范围(717±50)，丹酚酸B的信噪比（36.5, 131.1）均要优于不添加醋酸锌时的信噪比(27.6, 112.9)；在信号采集模式为MRM时，也呈现同样的规律。
   在HPLC/MS分析中，实验室常添加毫摩尔量级[9-10]的有机酸盐来提高待分析离子的离子化效率，而本文在此基础上添加微摩尔量级的醋酸锌，发现可以明显提高质谱的离子响应，这说明锌离子的存在有利于提高本实验条件下丹酚酸B的信号响应。
2.1.4 信号响应的稳定性
   从表1中可以看出，扫描范围相同时，在全扫描模式和MRM模式下获得的积分面积的相对标准偏差（RSD％）没有显著差异。较大的扫描范围获得的数据的RSD优于较小的扫描范围，均小于5％，说明本实验条件获得的实验结果有较好的重复性和稳定性。
   一般来说，离子阱进行定量分析时，采用MRM数据采集模式可以获得比全扫描模式更好的检出限，但由于扫描周期较长，数据较分散。本实验条件下，两种模式均可获得精密度较高的实验结果。
   综合上述结果，本实验采用2.2，2.3节所述的色谱条件和质谱条件对丹酚酸B进行定量分析。
2.2 方法学考察
2.2.1最低检测限
   采用该方法对一系列低浓度丹酚酸样品（0.4μM,0.3μM,0.2μM,.0.1μM,50nM）进行检测，确定最低检测限为0.2μM（S/N>5）。
2.2.2线性范围
   在0.5μM-10μM范围内均匀选择5个浓度，通过上述方法进行测定。每个浓度重复进样3次，以样品浓度对色谱峰积分面积平均值进行线性回归，获得丹酚酸B的浓度与信号响应的线性响应曲线y = 12.544x - 4.489，线性相关系数R=0.9990，浓度为0.5μM时S/N平均值为20.9，说明本实验条件下丹酚酸B在该浓度范围内有较好的线性关系。
2.2.3精密度和准确度
   分别选取中浓度（5μM）和低浓度（0.5μM）样品进行测定，重复进样5次。以色谱峰面积的相对标准偏差考察该方法的精密度，以回收率考察方法的准确度。两个浓度下的RSD值分别为2.08%和8.84%；方法回收率分别为91.6%，107.7%，说明本方法具有较好的精密度和准确度。

图2 空白血浆的和含药血浆的HPLC色谱图比较
（1）为空白血浆的和含药血浆的HPLC/UV（280nm）色谱图（A为空白，B为含药血浆）（2）空白血浆和含药血浆的HPLC/MS 的EIC m/z=717.0色谱图（A为空白，B含药血浆）。

2.2.4方法的选择性比较
   通过HPLC/ESI/MS联用分析对UV检测和MS检测的方法的专一性和选择性进行了比较。结果如图2。在图2中，（1）和（2）分别为空白血浆和含药血浆在相同条件下的HPLC/UV色谱图。
   图2（1）为空白血浆的和含药血浆的HPLC/UV（280nm）色谱图，箭头指示处为丹酚酸B的出峰位置，可以看出信号响应较弱，而且受到背景的干扰较大。（2）空白血浆和含药血浆的HPLC/MS 的EIC m/z=717.0色谱图，表明丹酚酸B的检测不受血浆背景基质的干扰。两图比较可以看出该方法的选择性明显优于紫外检测。
2.3 生物样品的测定
   按2.4节所列方法进行样品处理后，用本文的HPLC/MS法测定3只小鼠腹腔注射后血浆中的丹酚酸B含量分别为3.27μg/ml，2.22μg/ml，3.48μg/ml，平均血药浓度为2.99μg/ml。

3．结论
   通过优化色谱流动相组成和质谱的离子控制条件，本文建立了丹酚酸B的HPLC/ESI/MS定量分析方法，并发现微量的金属锌离子（Zn2＋）能提高丹酚酸B的ESI/MS负离子信号。该方法具有选择性好，灵敏度高，操作简单方便的优点。小鼠血浆样品的检测结果表明，本方法可用于对丹酚酸B进行药物代谢动力学等研究。

参考文献
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Quantitative determination of Salvianolic acid B by HPLC/ESI/MS
Jiaming Yang 1, Shengyuan Xiao 1, Xiaoling Mu 1,2, Yulin Deng 1,*
(1. School of Life Science  Technology, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;
2. The Chinese People’s Armed Police Forces Academy, Langfang 065000, China)
Abstract: An analytical method by HPLC/ESI/MS was established for quantitative determination of Salvianolic acid B (Sal B). The assay was linear over the concentration range from 0.5μM to 10μM, with the detection limit of 0.2μM. Using this method, the concentration of Sal B in plasma from ICR mice, which were administrated with a dose of 16mg/kg Sal B via intraperitoneal injection, had been estimated. With the advantages of higher selectivity and sensitivity, this method can be applied for accurate, convenient and rapid determination of biological specimen. In addition, it was discovered in our research that the intensity of Sal B signal in ESI/MS significantly increased when a trace of zinc cation existed.