流动注射-毛细管电泳-化学发光联用测定左旋多巴
周兴旺1，2 吕鉴泉2 何伟伟2 曾昭睿1*
（1武汉大学化学与分子科学学院 武汉 430072
2湖北师范学院生化分析重点实验室 黄石 435000）

摘要：改进了流动注射与毛细管电泳联用以及毛细管电泳与化学发光联用接口。基于多巴对鲁米诺-铁氰化钾体系化学发光的减弱作用，考察了两套接口装置联用时对多巴测定准确度及精密度的影响；优化了化学发光体系中鲁米诺及铁氰化钾浓度、溶剂、进样方式，运行缓冲种类、浓度、pH值以及毛细管电泳运行高压、进样时间；讨论了连续进样时峰交叉及峰重叠对测定结果的影响。结果表明，该联用体系对多巴测定的线性范围为0.5-50μg/mL，检测限为0.1μg/mL（S/N=3），测样速度为10样/h，10μg/mL左旋多巴连续出峰12次，峰面积RSD=3.2%。将其应用于美多芭片剂样品中左旋多巴含量的测定，结果满意。

关键词：毛细管电泳；化学发光；流动注射；联用技术；左旋多巴

    检测灵敏度的提高及分析结果的重现性是毛细管电泳（CE）技术对复杂样品进行定性和定量分析的关键。基于化学化光（CL）检测的高灵敏度以及毛细管电泳分离的高分辨率，近年来国内外有研究小组将毛细管电泳-化学发光技术联用并应用于无机离子及有机分子的分离与检测[1,2]。已有综述评论了该联用技术的进展[3]。流动注射(FI)是一种高效率的进样及在线溶液处理手段,1997年Kuban与方肇伦等相继报道了FI进样的CE系统[4,5]。与传统CE相比，FI-CE分析速度与测定精度显著提高。黄晓晶等曾报道在微流控芯片上成功实现流动注射-芯片电泳-化学发光联用。
本研究通过改进联用接口装置，首次在常规毛细管电泳仪上实现了流动注射-毛细管电泳-化学发光检测，将其成功应用于药片中左旋多巴含量的连续稳定测定。

仪器及试剂
    MPI-B型多参数化学发光分析测试系统（西安瑞迈电子科技有限公司），Cyberscan510型pH计（Eutch仪器有限公司），K2200H型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司），分离用毛细管（河北永年光纤厂，60cm×75 μm i.d.）；鲁米诺（97%, HPLC, Sigma,USA）铁氰化钾（Sigma,USA），左旋多巴标准品（Sigma,USA），多巴丝肼片（美多芭，上海罗氏制药有限公司）。实验中所用其余试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水；FI-CE接口材料为有机玻璃，CE-CL接口材料为聚四氟乙烯。
    鲁米诺储备液（0.1 mol/L）：1.7720 g 鲁米诺以0.5 mol/L NaOH溶解并定容至100.00 mL，避光保存。使用时以运行缓冲溶液稀释至所需浓度。
    铁氰化钾储备液(0.01mol/L)：0.3290 g 铁氰化钾以二次水溶解并定容至100.00 mL,避光保存。使用时以0.1 mol/L Na2CO3-NaOH (pH=13) 溶液稀释至所需浓度。
左旋多巴储备液(1.0mg/mL)：10.0mg左旋多巴以稀盐酸（pH=3.5）溶解并定容至10.00mL，冰箱中4℃避光保存。使用时以运行缓冲溶液稀释至所需浓度。

实验方法
1．仪器连接
    FI-CE-CL联用中接口连接的示意简图如图1所示。运行之前将K3Fe(CN)6溶液注至储液槽内一固定液面后以注射器手动加压以去除反应毛细管内的气泡，并使K3Fe(CN)6溶液充满于反应毛细管与分离毛细管之间。新毛细管使用之前分别用0.1 mol/L NaOH, 0.1 mol/L HCl，二次水各冲洗30分钟。每天使用之前以运行缓冲平衡分离毛细管10 min。光电倍增管高压设置为600V。样品与运行缓冲注入时泵速为60转/min。

图1：FI-CE-CL联用接口的连接示意图，其中1：分离毛细管；2：反应毛细管；3：铂电极；4：接地钢针电极；5：另一接地钢针电极插孔；6：发光试剂储液槽；7：样品及试剂三通；8：光电倍增管；9：信号处理系统；10：黑箱；11：高压源；12：样品入口；13：运行缓冲入口；A：FI-CE接口；B：CE-CL接口

2．实验条件的优化
   采用传统间歇式电动进样，运用毛细管电泳-化学发光联用系统考察不同浓度，pH值的磷酸盐缓冲，乙酸-乙酸钠缓冲，硼酸缓冲以及毛细管电泳运行高压，进样时间对多巴分离的影响，以峰形及重现性作为优化条件的标准。考察鲁米诺及铁氰化钾浓度、溶剂、进样方式对多巴检测的影响，以信噪比及重现性作为优化条件的标准。

3．药片中左旋多巴含量的测定
   每次测定时取左旋多巴样品（美多芭片）1片，以10 mL二次水超声溶解，此时溶液中左旋多巴的含量按标示值为20 mg/mL，以二次水稀释十倍后再以50 mmol/L硼酸缓冲溶液（pH=9.55）稀释100倍,用FI-CE-CL联用体系测定其中左旋多巴的含量，并与标示值进行比较。

结果与讨论
1．化学发光体系参数的优化
   文献[6]根据左旋多巴在碱性条件下对鲁米诺-铁氰化钾体系化学发光强度的增强作用，利用流动注射化光发光体系实现了左旋多巴片剂中含量的测定。本实验中发现，在毛细管电泳-化学发光联用系统中，左旋多巴在碱性条件下对鲁米诺-铁氰化钾体体系的化学发光有强烈的抑制作用，其机理有待更进一步探讨。毛细管电泳运行缓冲体系优化结果表明，在固定pH值及浓度条件下，使用磷酸盐缓冲体系峰形较为尖锐，但硼酸缓冲体系的电泳电流较小，基线稳定性较好，优化结果选用硼酸缓冲体系，浓度为50 mmol/L，毛细管运行高压为12000伏，电动进样条件为10000 V,10 s。鲁米诺加入运行缓冲溶液中，通过反应毛细管与铁氰化钾混合进行化学发光的模式所得结果的重现性最好。当硼酸缓冲体系(含2 mmol鲁米诺)pH值为9.55，铁氰化钾采用0.1 mol/L Na2CO3-NaOH (pH=13) 溶液溶解，浓度为0.12 mmol/L时，能得到最大信噪比，且基线稳定性好。

2．CE-CL接口
   实验结果表明，作为鞘流液的K3Fe(CN)6流速与反应毛细管流出物的流速相匹配时，所得基线平稳且基线光强的重现性好。根据实验过程中K3Fe(CN)6溶液的流速及消耗，设计了如图1所示的CE-CL接口装置。其优点在于储液槽与三通的一体化设计有利于提高接口运行的稳定性，实验结果表明K3Fe(CN)6的低流速所引起的储液槽中溶液液面变化可以忽略；将钢针直接套入反应毛细管末端并固定，将其作为接地电极伸入装满自来水至一定液面的1000毫升烧杯中，可以有效避免从钢针末端流出的溶液因表面张力的变化而导致K3Fe(CN)6流速改变所引起的基线不稳定。

3．FI-CE接口
   图1中当样品及试剂三通与FI-CE接口四通直接相连接时,经常会出现电泳电流异常增大而导致高压源自动保护的情况，其原因可能与高压启动时由于FI-CE联用所导致的蠕动泵输液管内溶液存在高压电场有关。采用如图1所示的四通接口与进样模式,以滴注的方式进样时电泳电流正常。实验结果表明，分离毛细管柱端与铂电极之间的距离对多巴出峰时间无显著性影响，当毛细管与铂电极之间的距离增大并靠近图1中的a点时，峰面积会明显增大。这可能与样品进入四通管道时被稀释的程度有关。选择合适的进样流速，在相同进样时间及进样高压条件下，由FI-CE-CL联用所导致的峰展宽同CE-CL联用所产生的峰展宽无显著性差异。实验中所选择的进样泵速为 60泵转/min。样品注入时间为10秒，样品注入后再以60转/min泵速注入运行缓冲20秒。

4．FI-CE-CL联用系统的分析性能
   实验结果表明，该联用体系对水样中左旋多巴测定的线性范围为0.5-50μg/mL，检测限为0.1μg/mL（S/N=3），测样速度由传统间歇式进样的2样/h提高为10样/h，10μg/mL左旋多巴连续出峰12次，峰面积RSD=3.2%。稀释后的美多芭样品溶液单次进样，二次连续进样中的峰交叉以及三次连续进样中的峰交叉与峰重叠的分离谱图如图2所示。计算结果表明,连续进样时产生的峰交叉与干扰峰的峰重叠对多巴峰面积以及出峰时间都无显著性影响。将鲁米诺-铁氰化钾发光体系应用于CE-CL联用时，其优点是基线稳定，毛细管电泳电流稳定，测定结果的重现性好。其不足表现在该发光体系易受干扰而导致测定时有干扰峰出现，而利用干扰峰的峰重叠可以有效减少干扰峰的存在，利用峰交叉可以有效提高进样频率。在多巴含量测定过程中观察到美多芭药片中的苄丝肼对化学发光体系也有减弱作用,当样品稀释至多巴标示含量为20μg/mL时(此时苄丝肼的标示含量为5μg/mL),苄丝肼无明显干扰峰出现，谱图中的干扰峰1，3为硼酸运行缓冲所产生。测定结果如表1所示。

表1： 美多芭片剂中左旋多巴含量的测定（每次连续进样3次，运行4次，左旋多巴共出峰12个）

图2：FI-CE-CL联用测定美多芭药片中的左旋多巴，图中峰1，3为未知干扰峰，峰2为左旋多巴；谱A为一次进样，谱B为二次进样时出现峰交叉，谱C为三次进样时出现峰交叉与峰重叠

结论
   在常规毛细管电泳仪中实现了流动注射-毛细管电泳-化学发光联用。利用该联用系统成功测定了药片中左旋多巴含量，连续进样时所产生峰交叉与峰重叠对多巴峰面积与出峰时间无显著性影响，因而可以利用峰交叉提高进样频率，利用峰重叠可以通过减少干扰峰的数量也能进一步提高进样频率。
   基于该FI-CE-CL联用体系，筛选出更多适合与毛细管电泳联用的稳定的化学发光体系以及高灵敏度的检测对象，结合流动注射技术中的在线样品预处理技术，梯度技术，可以有效提高分析过程的自动化程度以及测定结果的灵敏度与精密度。

参考文献
[1] Yang W P, Zhang Z Z, Deng W, Anal. Chim. Acta, 2003, 485: 169-177
[2] Hu Y G, Li X X, Pang Z T, J. Chromatogr. A, 2005, 1091: 194-198
[3] Kuyper C, Milofsky R, trends in analytical chemistry, 2001, 20: 232-240
[4] Kuban P, Engstrom A, olesson J C, Thorsen G, Tryzell R, Karlberg B, Anal. Chim. Acta, 1997, 337: 117-124
[5] Fang Z L, Liu Z S, Sheng Q, Anal. Chim Acta, 1997, 346: 135-143
[6] 胡玉斐,吕弋,何德勇,何树华,章竹君,分析试验室, 2004,23: 18-20

通讯联系人：曾昭睿，女，教授，博士生导师，E-mail: zrzeng@whu.edu.cn
基金项目：国家自然科学基金(No:20375028)；国家高技术研发计划(863计划No:2002AA2Z2004)