液相色谱串联质谱法测定血清中的司可异罗叶松甘油二酯、司可异罗叶松酯素、肠内二醇和肠内脂
杜业刚1 张伟2 张明3 丁昌明1 林少彬1
（1中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所 ，2 中国医学科学院肿瘤研究所， 3 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所）

摘要 目的 建立血清中司可异罗叶松甘油二酯（SDG）、司可异罗叶松酯素(Seco)、肠内二醇（EL）、肠内脂(ED)的液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）分析方法。方法 用β-葡萄糖醛酸苷酶酶解血清样品，采用电喷雾离子源，负离子MRM扫描。结果 本方法线性相关系数>0.9991，最低检出浓度（LOQ，S/N＝10）分别为SDG 50ng/ml, Seco 5.0ng/ml, EL 5.0ng/ml, ED 5.0ng/ml。空白血清加标回收率79.0%～105.6%，变异系数（CV，n＝6）<19.4% 。结论 LC/MS/MS法灵敏可靠，样品处理简单，适用于血清中SDG、Seco、EL、ED的检测。
关键词 LC/MS/MS 血清 木脂素

Detection of Secoisolariciresonol diglucoside, secoisolariciresinol, Enterolactone and Enterodiol in serum by LC/MS/MS

Abstract Objective To establish a method used for determination of Secoisolariciresonol diglucoside(SDG), secoisolariciresinol(Seco), Enterolactone(EL) and Enterodiol(ED) in serum by LC/MS/MS. Method β-Glucuronidase was used to hydrolyze the serum samples, the electrospray ionization sourse and negative ion MRM scan were employed. Results The linearity correlation coefficients (r) was >0.9991. The limit of quantification (LOQ, S/N=10) was 50ng/ml for SDG, 5.0ng/ml for Seco, 5.0ng/ml for EL and 5.0ng/ml for ED. The spiked recovery in blank serum sample ranged from 79.0% to 105.6% with coefficient of variation (CV, n=6) less than 19.4%. Conclusion The method of LC/MS/MS is sensitive and reliable, and the samples handling is simple, which is suitable for determination of SDG、Seco、EL、ED in serum sample.
Keywords LC/MS/MS serum lignan

     在人的食物中发现的植物雌激素分为异黄酮类和木脂素类（lignans），其中木脂素类包括有：肠内脂(Enterolactone)、肠内二醇(Enterodiol)、司可异罗叶松甘油二酯(Secoisolariciresonol diglucoside)。肠内脂和肠内二醇由植物中的司可异罗叶松酯素(secoisolariciresinol)和罗汉松酯素(matairesinol)衍生而来[1-3]。植物雌激素的化学结构相似人体内源性雌激素，它们在生理上起着雌激素和抗雌激素的作用，对生理和病理均有一定的影响。由于木脂素对一些癌症（乳腺癌、前列腺癌、子宫癌和结肠癌）可能具有预防和治疗作用[4,5]，近来越来越引起人们的关注。本法建立了测定血清中木脂素的LC/MS/MS分析方法，为今后对木脂素的进一步研究，开发新的抗癌药物提供了可靠的检测手段。
1. 材料与方法
1.1仪器与条件
        Applied Biosystems公司API4000串联质谱仪；Agilent 1100 系列高效液相色谱仪；Scientific Industries 涡流振荡器；N-EVAP氮吹仪；Mettler AE 163十万分之一分析天平；Barnstead纯水机；高速离心机。
色谱条件： Waters Symmetry®C18（150×3.9mm，5μm）色谱柱；流动相：甲醇：5mmol/L乙酸铵（70：30）；流速：300μl/min；柱温：室温；进样量：5μl。
质谱条件：电喷雾离子源ESI；负离子MRM扫描；碰撞活化参数（CAD）：5；气帘气（CUR）：25psi；雾化气（GS1）：35psi；辅助气（GS2）：35psi；离子源电压（IS）：－4500V；离子源温度（TEM）：450C。
1.2试剂
         SDG、Seco标准品由中国医学科学院肿瘤研究所提供；EL、ED 、β-葡萄糖醛酸苷酶标准品由Sigma公司提供，甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯，无水乙酸钠和盐酸为分析纯。
1.3标准溶液的配制
        称取一定量的SDG、Seco、EL、ED标准品于5ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容到刻度，得浓度分别为SDG 2.61 mg/ml 、Seco 1.90 mg/ml、EL 2.00 mg/ml、ED 2.00 mg/ml的标准贮备液。准确量取上述标准贮备液适量，用甲醇稀释配制成浓度为SDG 100μg/ml 、Seco 50μg/ml、EL 10μg/ml、ED 10μg/ml的混合标准使用液。
       准确称取0.41g无水乙酸钠，加入去离子水，用1M HCl调节pH值至5.0，定容至1L，得到5mM 乙酸钠缓冲液。
       准确称取0.3056g β-葡萄糖醛酸苷酶，用乙酸钠缓冲液定容至10ml，得到12.0 units/µl的β-葡萄糖醛酸苷酶溶液。
1.4 样品前处理[6]
      准确移取100µl血清于2ml试管中，加入100µl(1200units) β-葡萄糖醛酸苷酶溶液，在37℃水浴下，水解24h，加入400µl乙酸乙酯，振荡3min，离心2min（10000rpm），取出上层的乙酸乙酯层，用N2吹干，加入100µl流动相溶解后进样分析。
1.5 计算
ρx=ρ1v1/vx
式中：ρx－血清中木脂素的浓度，ng/ml；
ρ1－测试液中木脂素的浓度，ng/ml；
v1－测试液的体积，ml；
vx－血清的体积，ml。
2. 结果与讨论
2.1 质谱和色谱行为
首先经Q1全扫描选择母离子，然后进行二级质谱扫描，得到四种化合物的二级质谱图如图1。根据质谱图分析结果，选定进行MRM扫描的离子通道：SDG m/z 685.5（523.6；361.4）；Seco m/z 361.0（346.3；165.2）；EL m/z 297.0（253.2；189.2）；ED m/z 301.0（271.3；253.2）。

a                                                                                                 b

c                                                                                           d
图1 SDG、Seco、EL、ED的二级质谱图
Figure 1 The MS/MS spectrum of SDG，Seco，EL and ED
（a—SDG，b—Seco，c—EL，d—ED）

      在选定的仪器条件下，混合标准溶液液相色谱图如图2，从图中可以看出SDG、Seco、EL和ED的保留时间分别为：3.28min，3.86min，4.61min和4.32min，色谱行为良好。

图2 SDG、Seco、EL、ED的液相色谱图
Figure 2 The LC chromatogram of SDG、Seco、EL and ED

2.2线性范围
      在空白血清中添加不同量的混合标准溶液，按照前面所述样品前处理方法及仪器条件进行测定，以样品的浓度（x，ng/ml）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标（外标法），进行线性回归方程计算，考查线性范围。
     测定结果得出，SDG在0～1000ng/ml、Seco在0～500ng/ml、EL在0～200ng/ml、ED在0～200ng/ml的浓度范围内线性关系良好，线性相关系数>0.9991，回归方程及线性相关系数见表1。

2.3最低检测浓度（LOQ）
      采用信噪比S/N＝10来计算最低检测浓度，得到本方法的最低检出浓度分别为SDG 50.0ng/ml、Seco 5.0 ng/ml、EL 1.0 ng/ml、ED 1.0 ng/ml。
2.4回收率和精密度
      在100µl空白血清样品中加入浓度分别为SDG 100.0ng/ml、Seco 50.0 ng/ml、EL 10.0 ng/ml、ED 10.0 ng/ml的混合标准溶液，按照所述前处理方法处理后进样分析，计算回收率和精密度，见表2。

      从表中结果可以看出本方法的回收率范围在79.0%～105.6%之间，具有较好的回收率，变异系数（CV）<19.4％，精密度也比较好。
2.5 方法特点
     本方法仅采用少量的溶剂来萃取酶解后的血清样品，使用溶剂少，减少了溶剂危害，快速准确、灵敏可靠。采用空白血清添加来评价方法，结果表明，空白血清无干扰。图3是空白血清和样品的色谱图。

a

b
图3 空白血清和样品测定色谱图
Figure 3 The chromatogram of blank and unknown serum sample
（a-blank serum；b-unknown serum）

3. 方法应用
     依照本文所述方法对中国医学科学院肿瘤研究所提供的一批服药病人的血清样品进行测定。定量计算结果，得出血清样品中木脂素及其代谢产物的含量见表3。

参考文献：
[1] M.Axelson, K.D.R.Setchell, The excretion of lignans in rats-evidence for an intestinal bacterial source for this new group of compounds, FEBS Letters 123 (1981) 337-343.
[2] K.D.R.Setchell, M.Axelson, Origin of lignans in mammals and identification of a precursor from plants, Nature 298 (1982) 659-660.
[3] L.U. Thompson, H.H.Hill, T.D.Shultz, Quantification of mammalian lignans in biological fluids using gas chromatography 617 (1993) 173-179.
[4] D.P.Rose, Dietary fiber, phytoestrogens, and breast cancer, Nutrition 8 (1992) 47-51.
[5] H.Adlercreutz, Phytoestrogens: epidemiology and a possible role in cancer protection, Environmental Health Perspectives 103 (1995) 103-112.
[6] E.Jacobs, S.E.Kulling, M.Metzler, Novel metabolites of the mammalian lignans enterolactone and enterodiol in human urine, Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 68 (1999) 211-218.