制备高效液相色谱法分离百蕊草中山奈酚
蒋丹，戴荣继，刘洋，禹玉洪，邓玉林 bitjingdan@163.com

摘要：目的 研究百蕊草的化学成分，应用制备高效液相法分离百蕊草中的山奈酚。方法 系统溶剂萃取法与硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱等方法相结合，从百蕊草全草中分离得到山奈酚粗品，经PHPLC纯化后，得到化合物I和化合物II，通过紫外光谱、质谱、核磁等方法鉴定其化学结构。结果 自百蕊草中分离得到化合物I为异黄酮类化合物 和化合物II为山奈酚。经HPLC分析其纯度达98%以上。结论 PHPLC用于百蕊草中山奈酚的分离，简便宜行，所得产物纯度高。
关键词：百蕊草，制备型HPLC，山奈酚

1．前言
   百蕊草，别名小草，百乳草，一棵松等，为檀香科植物百蕊草(Thesium chinese Turcz.)的全草[ ]。资源丰富,全国各地均有分布。苦涩，性温，补气益肾，清热解毒，对多种致病菌有抑制作用，主治肾虚腰痛，肾虚头晕，急性乳腺炎，大叶性肺炎等多种炎症疾病，疗效显著、无毒副作用。百蕊草中含有黄酮、有机酸、生物碱、甾醇、酚类、挥发油等多种化学成分，其中黄酮类化合物具有一定抗菌活性。目前，已有研究采用常压柱色谱方法分离黄酮类化合物山奈酚，但此法耗时耗力，产物纯度低[ ]。本实验采用制备高效液相色谱法(PHPLC)制备山奈酚，简便宜行，稳定性好，重现性高，所得产物纯度高。

2．实验部分
2.1 仪器和试剂
   岛津半制备型高效液相色谱仪：LC-6AD高压输液泵，LC-10AF自动进样器，SPDM-10Avp二极管阵列检测器，SCL-10Avp系统控制器，FRC-10Avp组份收集器，CLASS-VP工作站。大连依利特高效液相色谱仪：P230高压恒流泵，PDA230二极管阵列检测器，EC2000色谱工作站，7725i Rheodyne手动进样阀，20μl定量环。
   乙腈为色谱纯（Fisher公司)，水为娃哈哈纯净水，使用前经0.45μm滤膜过滤。其它试剂均为分析纯。
   百蕊草药材采于安徽省东至县，由北京大学药学院天然药物系药用植物研究室陈虎彪教授鉴定为百蕊草的干燥全草。

2.2 色谱条件
   制备色谱条件：半制备色谱柱为shim-pack prep-ODS(H)KIT 20mm i.d.×250mm，5μm。流动相：ACN/H2O（v/v,35：65）。体积流量：8ml/min。检测波长：260nm。进样量：100μl。
分析色谱条件：色谱柱为DiamonsilTM(钻石) C¬18，4.6mm i.d. ×250mm，5μm。流动相：ACN/H2O（v/v,35：65）。体积流量：1ml/min。检测波长：260nm。进样量：20μl。
2.3 实验方法
2.3.1山奈酚粗品的制备
   将药材用80%乙醇提取，滤液浓缩后过滤，所得滤液依次用氯仿、乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯部分过200-300目硅胶柱，氯仿甲醇梯度洗脱，收集氯仿：甲醇9：1部分，经聚酰胺柱色谱分离，依次用水、95%乙醇洗脱。将95%乙醇洗脱部分浓缩后经葡聚糖凝胶柱色谱细分，甲醇洗脱，即得山奈酚粗品。
2.3.2 样品溶液的配制
   取山奈酚粗品（淡黄色粉末）40mg，用3.5ml色谱纯甲醇溶解，0.45μm过滤器过滤后，呈黄色溶液，所得样品溶液浓度为11.4mg/ml。
2.3.3 山奈酚的制备
   将配制好的样品溶液通过岛津半制备高效液相色谱仪分离纯化，每次进样量100μl，相当于样品量1.14mg，可使化合物I和化合物II达到全完分离。制备HPLC色谱图见图1。分别收集化合物I和化合物II的流份，减压浓缩后干燥。

图1 混合样品的PHPLC色谱图

3．结果与讨论
3.1 所得产物纯度检测
   用分析型HPLC对分离后的化合物I和化合物II进行纯度检测，得知经制备液相纯化后化合物纯度达98%以上。结合DAD检测器检验目标峰纯度达到99%以上。

图 2 （a）和（b）分别为化合物I和化合物II的HPLC色谱图及UV光谱图

3.2 化合物的结构鉴定
   通过紫外光谱，质谱，核磁等方法进行结构鉴定，并与文献数据[ ]相比较，得知化合物II为黄酮类化合物山奈酚。
3.3 色谱条件的选择
3.3.1 流速的选择
   根据公式：制备柱流速=分析柱流速×（D2/D1）2，计算出由分析到制备体积流量应放大到约19ml/min。但流速过大，将使柱压大副度上升，极大地降低柱子的使用寿命，且峰形变差。再综合考虑泵的输液能力及分离时间等因素，选择流速为8ml/min。
3.3.2 检测波长的选择
   化合物II的最大吸收波长365nm，但化合物I的在365nm处几乎无吸收。所以选择260nm作为检测波长，以增加制备收集的准确度。
3.3.3 进样量的选择
   进样量小浪费时间和溶剂，进样量太大，分离效果不好，影响产物纯度。确定进样量时，在较高浓度下，逐渐增大进样体积，直到产物峰与最邻近杂质峰相接触，此时为最佳进样量。通过实验确定进样量为100μl。
4．结论
   应用制备高效液相法分离百蕊草中山奈酚，此法方便快捷，简单易行，且所得产物纯度高。PHPLC不失为中药化学成分研究的好方法。

参考文献

[ ] 鲁云霞，汪俊松。百蕊草的化学成分研究[J]。中草药。2004，35（5）：491-492。
[ ] 李育智。百蕊草中山奈酚的分离及鉴定[J]。基层中药杂志。2001，15（3）：23。
[ ] 国家医药管理局中草药情报中心站。植物药有效成分手册[M]。北京：人民卫生出版社，1986。