百蕊草中生物碱类物质的分离及其HPLC-DAD特征图谱研究
刘洋 邓玉林* 禹玉洪 戴荣继 孟薇薇
（北京理工大学生命科学与技术学院，北京，100081）
010-68949331 y-lew126.com

摘要 目的 对分离的百蕊草中生物碱类物质进行了定性分析。方法 高效液相色谱—二极管阵列检测器联用(HPLC -DAD) ，并与TLC方法进行比较。结果 流动相为乙腈－醋酸水（pH=3.85），流速为1.0mL /min，检测波长为294nm，进行梯度洗脱，在HPLC图谱上百蕊草提取液中主要生物碱可得到理想分离，与TLC图谱相比，分离效果好，灵敏度高；此外，DAD检测器还提供了生物碱物质的紫外光谱。结论 HPLC-DAD图谱可为定性分析提供依据，并可在一定程度上进行百蕊草生物碱物质的质量控制。
关键词 百蕊草，生物碱，HPLC-DAD

1 引 言
    百蕊草,别名小草,百乳草,地石榴等,为檀香科(Santalaceae)植物百蕊草(ThesiumChinenseTurcz.)的全草。资源丰富,全国各地均有分布,具有清热解毒,补肾涩精,治疗急性乳腺炎、急性扁桃腺炎、咽炎、肺炎、肺脓疡、上呼吸道感染、肾虚腰痛、遗精涩精等[1]。百蕊草中含有黄酮、有机酸、生物碱、甾醇、酚类、挥发油等多种化学成分。经抗菌实验证明，百蕊草总黄酮、有机酸和生物碱部分都有一定的抗菌活性[2,3]，其中生物碱物质因为含量低，不易分离提纯，未见有研究报道，本文选用合适的方法从百蕊草中分离出生物碱部分，通过HPLC -DAD方法对其进行定性分析，以便为今后的质量控制奠定基础。

2 实验部分
2.1仪器与试剂
    P200II型高效液相色谱仪（大连依利特公司），高压恒流泵，二极管阵列检测器（DAD），Echrom2000色谱工作站。高效薄层层析硅胶G板(美国大西洋公司)。
    乙腈(色谱纯)；Millipore三蒸水(自制)；次硝酸铋、乙醇、乙酸乙酯、浓氨水、盐酸，冰醋酸 (均为分析纯)。碘化铋钾试剂：溶液I：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸与40ml水中。溶液II：8g碘化钾溶于20ml水中。贮备液：溶液I与溶液II 等体积混合。喷雾剂：1ml贮备液与2ml醋酸，10ml水混合而得。
   百蕊草药材采于安徽省东至县，由北京大学药学院天然药物系药用植物研究室陈虎彪教授鉴定为百蕊草(Thesium chinese Turcz.)的干燥全草。
2.2生物碱提取物的制备
   取100g干燥的百蕊草粗粉，加入一定量的80％乙醇水溶液回流提取2次，每次1h，合并两次提取液，浓缩减压回收乙醇至无醇味，加入适量的稀盐酸将浓缩液调至pH=3，抽滤，滤液用氯仿溶液多次萃取至下层氯仿层颜色近无色后，将上层酸水层分离，再用10％氨水溶液调至酸水层溶液至pH=10后，在碱性状态下，用氯仿萃取，多次萃取后得到下层氯仿层溶液，即总生物碱部分。减压浓缩,无水乙醇溶解定容。过0.45μm微孔滤膜，作为百蕊草的生物碱提取液供试品。
2.3 薄层色谱展开方法
   吸附剂：硅胶G；展开剂：乙酸乙酯：乙醇：浓氨水 (5∶1∶0.5)；显色剂：碘化铋钾试剂。
   将上述生物碱提取液供试品，进行TLC分析。展开后将展开剂挥干, 再喷以碘化铋钾试剂显色，观察斑点。
2.4 液相色谱条件
    色谱柱：钻石Diamonsil ODS C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈与醋酸水(pH=3.85)，进行梯度洗脱；流速：1mL/min；.紫外检测波长：294nm；进样方式：手动进样；进样量：10μL。

3 结果与讨论
3.1 生物碱提取物的TLC图谱
   从图1的TLC可以看出，使用碘化铋钾喷雾显色后，硅胶板上出现8个清晰的红色斑点，可以初步判定此斑点为生物碱物质。说明通过碱溶酸沉、溶剂萃取法可以有效地富集百蕊草中的生物碱类成分。
   此展开剂条件是从多种展开系统中筛选、优化得到的。从展开系统来看，百蕊草中生物碱物质极性偏大，用氨水调节展开系统为偏碱性，有利于抑制生物碱物质的在硅胶板上的死吸附，避免拖尾，从而使其得到较好的分离。该方法操作简便，重现性高，不失为百蕊草中生物碱物质的定性评价的一种好方法。

图1　百蕊草生物碱提取物的薄层色谱图
Fig.1　TLC chromatogram of alkaloid extract of ThesiumChinenseTurcz.

3.2 生物碱提取物的HPLC－DAD图谱

图2 百蕊草生物碱提取物的高效液相色谱图
Fig.2　 High Performance Liquid Chromatograph of alkaloid extract of ThesiumChinenseTurcz.

    当检测波长为294nm时, 百蕊草生物碱提取液提取液的高效液相色谱图如图2所示。由此可看出，HPLC-DAD图谱所显示的信息比起TLC图谱更为丰富，除了主要的几个含量相对大的生物碱峰，还有许多含量较低的小峰。图3显示的是百蕊草生物碱提取物的全局三维图。相对单仪器的色谱分离来说,高效液相色谱－二极管阵列检测器联用仪(HPLC-DAD)所得数据为三维数据,即数据同时包含了光谱与色谱信息。光谱能提供化学物质的大量定性信息，而色谱曲线能提供定量信息。如果条件控制得好,化学物质的保留时间对化学物质的定性也是很有帮助的，联用仪产生的三维数据中的光谱信息则为指纹图谱研究提供了新的信息。主要的色谱峰对应的紫外光谱图如图4所示。

图3 百蕊草生物碱提取物的全局三维图
Fig.3　 Overall Situation 3D Figure of alkaloid extract of ThesiumChinenseTurcz.
 

(a)—图2中的第1个色谱峰；(b)—图2中的第2个色谱峰；(c)—图2中的第3个色谱峰；(d)—图2中的第4个色谱峰；(e)—图2中的第5个色谱峰；(f)—图2中的第6个色谱峰；(g)—图2中的第7个色谱峰；(h)—图2中的第8个色谱峰
图4　百蕊草生物碱提取物的紫外光谱
Fig.4　UV spectra of alkaloid extract of ThesiumChinenseTurcz.

4 结论
   由于百蕊草中生物碱种类繁多，且大多数含量不高，通过本实验方法可将其有效地进行富集。HPLC-DAD可使百蕊草中的生物碱成分得到很好的分离，并对主要色谱峰可进行初步定性。目前，由于我们对生物碱各有效成分在体内的变化规律尚未弄清,故在检验中未进行具体定量分析，只是使用HPLC-DAD色谱与光谱图相结合进行了定性分析。在中药分析中，质谱检测器因具有信息量更丰富、应用范围更广等优势，得到了广泛的认可。今后可以尝试LC/MS方法对百蕊草中生物碱进行定量定性分析，对我们的工作也是一个很好的补充。

参考文献

[1]　江苏新医学院:中药大辞典,上册.上海:上海科学技术出版社1981:866.
[2]　安徽省医学科学研究所植化室百蕊草组.百蕊草有效成分的化学研究(第一报).中草药通讯,1976;(8):6
[3]　安徽省医学科学研究所植化室百蕊草组.百蕊草有效成分的化学研究(第二报).中草药通讯,1976;(9):9