水产品中残留孔雀石绿和无色孔雀石绿的
液质联用分析方法研究
冯雷[1]，孙文通[1]，张承聪[2] wgh_swt@sina.com
（1、云南省产品质量监督检验中心，云南 昆明，650203；
2、云南大学化学系，云南 昆明，650091）

摘要：本文研究了一种针对水产品中残留孔雀石绿和无色孔雀石绿的液质联用分析方法。采用固相萃取方法对样品中的目标物进行净化前处理，采用普通C18柱和乙腈-醋酸铵缓冲液流动相系统对孔雀石绿和无色孔雀石绿进行分离，用质谱进行检测，缩短了色谱分离时间，提高了检测灵敏度和分析结果可靠性。并对柱后衍生化和非衍生化方法以及DAD和MS检测方法进行了比较。本方法具有准确、快速以及灵敏度高的特点，能够适应大规模样品的快速分析要求，目前此方法已经用于水产品中残留孔雀石绿的分析检测。
关键词：孔雀石绿、无色孔雀石绿、液质联用、水产品

1、引言
   孔雀石绿（Malachite green, MG）属于三苯甲烷类染料，为金属光泽的结晶体，极易溶于水，水溶液呈蓝绿色 [1] 。孔雀石绿在鱼体内可迅速代谢为无色孔雀石绿（Leucomalachite green，LMG）[2]，因此常用无色孔雀石绿作为标记物。孔雀石绿和无色孔雀石绿之间可相互转化，见图1。孔雀石绿开始被用于纺织物的染色，1933年后被广泛用于水产品养殖业，其具有优良的杀虫、杀菌和防腐作用，可防治鱼类的水霉病、白斑病、烂鳃病以及寄生虫病等[3、4]。由于孔雀石绿和无色孔雀石绿均具有潜在的致癌、致畸、致突变作用[3]，目前已被大多数国家禁止用于水产品养殖业。我国在2002年将孔雀石绿列为渔业禁用药物，但由于其价格低廉、抗菌杀菌效果好，仍有少数不法商贩和养殖户在使用。因此对于水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留物的检测和监控对于人民的食品安全显得格外重要。

图1、孔雀石绿和无色孔雀石绿结构图
Fig.1 The structure of MG and LMG

     目前，分析水产品中残留孔雀石绿和无色孔雀石绿的方法主要为液相色谱法。由于无色孔雀石绿在可见光区没有吸收，常使用柱后PbO2氧化柱将无色孔雀石绿氧化为孔雀石绿，以便检测[5-7]。柱后衍生化很好的解决了无色孔雀石绿紫外检测的难点，但柱后衍生容易造成柱后死体积增大，影响色谱分离效果。Kamila Mitrowska等人采用紫外-可见光检测器与荧光检测器串联检测，分别检测孔雀石绿和无色孔雀石绿的方法，避免了柱后氧化柱的使用[8]。Matysik报道了使用非水毛细管电泳-电化学检测分析孔雀石绿的方法[9]，得到了很好的分离效果。对于食品中孔雀石绿的检测，定性比定量更为重要，采用光谱方法进行检测容易出现假阳性检测结果，如果采用质谱进行检测就可以大大降低假阳性检测结果的检出率。液质联用系统是残留分析的理想手段，对于需要高灵敏度、宽适用范围、复杂基质的残留检测，液质联用无疑是首选的最佳检测手段[10]。国外研究者开发了很多水产品中的残留孔雀石绿的液质联用方法[11-13]，大多使用了柱后衍生（PbO2氧化）技术，在接口技术方面，有的采用大气压化学电离源，有的采用离子喷雾技术。这些方法均可以较好的完成水产品中孔雀石绿和无色孔无色孔雀石绿的分析。
     本文开发了一种无需衍生化，采用LC-ESI-MS联用系统直接分析水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿的方法，采用质谱定性和定量，降低了假阳性检测结果的出现机率，提高了检测的准确性和检测灵敏度，并对衍生化方法和非衍生化方法，光谱检测方法和质谱检测方法进行了对比讨论。本方法运用到实际样品的检测中结果令人满意。

2、实验部分
2.1试剂
     孔雀石绿及无色孔雀石绿标样（美国Sigma公司），乙腈（色谱纯，美国Fisher公司），超纯水。醋酸铵、盐酸羟胺、对甲苯磺酸、中性氧化铝、二甘醇、二氯甲烷、甲醇等均为分析纯。
2.2仪器与条件
     SHIMADZU LCMS-2010A液质联用仪（日本，岛津），包括两台LC-10ADvp高压泵，DGU-12AM真空脱气机，SIL-HTc自动进样器，CTO-M10Avp柱温箱，SPD-10ASvp光电二极管阵列监测器和MS-2010A质谱仪。分离色谱柱为岛津公司Shim-pack VP-ODS150×2.0mm，预柱为岛津公司Shim-pack VP-ODS10×2.0mm，柱后衍生柱为自制的PbO2氧化柱（150×2.0mm），用PbO2填充。PRS丙磺酸固相萃取柱（500mg，3mL），自制氧化铝固相萃取柱。OA-SYS氮吹仪，GL-2OG-Ⅱ型高速离心机。
     流动相A为乙睛， B为0.05mol/L醋酸铵缓冲溶液（pH=4.5），流动相流速0.5mL/min。流动相梯度见表1。柱温30℃，进样量10μL ，DAD检测器扫描波长范围为200-800nm，检测波长为618nm。质谱仪接口为正离子模式的电喷雾离子源，喷雾口电压1.5kV，喷雾气和干燥气为氮气，喷雾气流速1.50L/min，干燥氮气（反吹）压力为0.2MPa，CDL电压：－10.0kV，CDL温度：250℃，模块温度200℃。

表1.流动相梯度
Tabble1. The gradient of mobile phase

2.3、标准溶液的配制
     准确称取100mg孔雀石绿和无色孔雀石绿标准样品于烧杯中，用乙腈溶解定容至100mL，得到1mg/mL的标准溶液，稀释1000倍后得到1μg/mL的标准溶液储备液。逐级稀释得到标准工作溶液。标准溶液需避光保存在-18℃的冰箱中可稳定60天。
2.4、样品前处理
     准确称取5.0g均质样品于三角瓶中，加入20%盐酸羟胺溶液3mL，1.0mol/mL的对甲苯磺酸溶液5mL，0.05mol/L醋酸铵缓冲溶液（pH=4.5）20mL后，加塞摇匀后震荡30min。然后将溶液全部转入50mL离心管中，用10mL乙腈冲洗三角瓶后并入离心管中，加入20g中性氧化铝后剧烈震荡30s，以3000rps的转速离心10min。将上清液全部转移至预先装有10mL水和2mL二甘醇的100mL离心管中。然后在离心管中加入10mL乙腈，重复上述操作，将上清液转移至同一100mL离心管中。
     在100mL离心管中加入15mL二氯甲烷进行萃取，然后以3000rps的转速离心10min使其分层，将二氯甲烷层转移至浓缩管中，再用10mL二氯甲烷对水相进行萃取，重复上述操作一次，合并二氯甲烷层，用氮吹仪浓缩至1mL。
     用5mL乙腈溶解浓缩液后进行固相萃取。PRS小柱上端连接中性氧化铝小柱，用5mL乙腈活化固相萃取小柱，将浓缩液转移至氧化铝小柱上，再用5mL乙腈分两次洗涤浓缩管，把洗涤液依次过柱，待溶液全部流入PRS小柱后，弃其中性氧化铝小柱，依次用1mL醋酸铵溶液、1mL乙腈和1mL0.2%盐酸羟胺甲醇溶液洗脱PRS小柱，收集洗脱液，浓缩定容至1mL后过0.45μm滤头后供色谱测定。

3、结果与讨论
3.1 色谱条件优化
     目前大多数分析水产品中残留孔雀石绿的方法采用的都是氰基柱，分离效果虽好，但分析时间较长，且维护较为繁琐。本方法采用普通C18柱和乙腈-醋酸铵缓冲液流动相系统对孔雀石绿和无色孔雀石绿进行分离，不仅能很好地分离孔雀石绿、无色孔雀石绿以及干扰组分，还大大缩短了色谱分析时间，仅需十分钟就能完成色谱分离。
3.2柱后衍生化方法
    由于无色孔雀石绿在可见光区没有吸收，其最大吸收260nm处干扰大，因此在分析无色孔雀石绿时一般对其进行衍生化，通常采用柱前氧化或柱后氧化方法。柱前氧化方法只能间接测定无色孔雀石绿，而柱后氧化法先将孔雀石绿和无色孔雀石绿分离后再对无色孔雀石绿进行氧化，将其氧化成为孔雀石绿，以便可用紫外检测器检测。柱后衍生化色谱图见图2。

图2、柱后衍生化色谱图
Fig.2 The Chromatography of derivation

3.3直接检测法
   若不进行衍生化，用PDA检测器在618nm只能检测到孔雀石绿，见图3。若用260nm对无色孔雀石绿进行检测时，其干扰较多，不利于定性和定量。在非衍生的条件下，若采用质谱进行检测，可以同时检测孔雀石绿和无色孔雀石绿，且检测灵敏度大大提高，其总离子流图见图4，质谱扫描范围为300~400。

图3、非衍生化色谱图
Fig.3 The Chromatography of underivation

图4、非衍生化总离子流图
Fig.4 The TIC of underivation

    孔雀石绿和无色孔雀石绿的ESI-MS质谱图见图5。孔雀石绿的特征碎片离子的荷质比为329，为[M+]峰。无色孔雀石绿的特征碎片离子的荷质比为331和372，331为[M+H]+的分子离子峰，372为[M+MeCN]+的离子峰，即无色孔雀石绿与乙腈的加合离子峰。由于无色孔雀石绿的372特征碎片强度大大高于331的分子离子峰强度，检测时采用372作为无色孔雀石绿的检测依据。图3与图4比较可以看出，在非衍生化条件下，检测无色孔雀石绿只能用质谱检测器。图6为选择离子模（SIM）式下（监测离子329和372）的离子碎片图（MIC）。在选择离子模式下，质谱对孔雀石绿和无色孔雀石绿的检测灵敏度比扫描模式下高得多。

图5、孔雀石绿和无色孔雀石绿的质谱图
Fig.5 The MS Spectrum of MG and LMG

图6、非衍生化离子碎片图
Fig.6 The MIC of underivation

    表2为不同检测方法的孔雀石绿及无色孔雀石绿最低检出限，其检出限以信噪比为3时计算得到。对比可知，质谱监测灵敏度优于紫外，而选择离子模式下，质谱监测灵敏度更高。在水产品中的孔雀石绿残留量一般为ppb级，因此在水产品中孔雀石绿残留量的检测最好选用选择离子模式下的质谱检测。

表2、不同检测方法的孔雀石绿及无色孔雀石绿最低检出限（S/N=3）
Table.2 The Detect Limit of MG and LMG （S/N=3）

3.4定量回归方程及相关系数
      配置孔雀石绿和无色孔雀石绿浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL的标准工作溶液，依次进样后以峰面积为Y轴，浓度为X轴，进行线性回归得到孔雀石绿及无色孔雀石绿的定量方程，见表3。

表3、线性回归方程及相关系数
Tabble.3 The Linear Regressive Function and Correlativity

3.5方法精密度及回收率
      实验中采用空白样品加标进行回收率的测定，分别进行了1ng/mL和10ng/mL两个水平在空白样品中加入标准溶液进行回收率实验，每个水平做5次平行试验，得到平均回收率及相对标准偏差见表5。孔雀石绿的回收率较和重现性好，但无色孔雀石绿的较差，这可能是由于无色孔雀石绿不稳定，容易被氧化的原因。两者的精密度均可以满足痕量残留物的分析要求。

表5、方法精密度和回收率（n＝5）
Tab.5 The recovery and precision of method（n＝5）

3.6 样品检测结果

图7、鳗鱼样品的选择离子流图
Fig.7 The MIC of sample

      按照本文所述方法对实际样品进行分析， 图7为鳗鱼样品中孔雀石绿的选择离子流图（MIC），从图中可以看出，样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿均很好地被分离，且分析时间很短，只需十分钟即可完成一次分析。说明本方法运用到实际样品的检测中可以得到较好的分离分析结果。部分样品中孔雀石绿和无色孔雀石绿的含量见表6。

表6、部分样品中孔雀石绿和无色孔雀石绿的含量
Tab.6 The contents of MG and LMG in samples

注：“-”表示未检出。

     本方法采用固相萃取技术对样品进行前处理预分离，用液质联用方法分析水产品中残留孔雀石绿和无色孔雀石绿。本方法优化了色谱条件，采用普通碳十八柱即可对孔雀石绿和无色孔雀石绿进行分析，且大大缩短了分析时间，提高了分析效率。由于本方法采用了MS检测，能够有效排除假阳性检测结果，能够对可能含有孔雀石绿和无色孔雀石绿的样品进行准确、可靠、权威的分析检测。本方法具有准确、快速以及灵敏度高的特点，能够适应大规模样品的快速分析要求，目前此方法已经用于水产品中残留孔雀石绿的分析检测。

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