高效液相色谱测定磷脂研究进展
崔 莹
（华东师范大学河口海岸学国家重点实验室，上海200062）
崔莹 华东师范大学河口海岸学国家重点实验室，电话：021-62237520，62233421
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摘要:天然磷脂是一类含磷酸的类脂化合物，广泛存在于植物的种子，动物的脑、肝、卵和微生物体中，在工业生产、食品科学、医药学、生命科学研究方面都有重要的应用。磷脂的研究手段有多种，本文综述了高效液相色谱分离、检测不同来源样品中磷脂的方法。
关键词:天然磷脂;高效液相色谱法;分离;检测

1、前言
      磷脂类化合物是细胞膜的主要成分之一，在水介质中形成双分子层构成生物膜的骨架，其含量约占细胞干重的5%。分子生物学研究发现，磷脂是重要的生物活性物质及信息分子前体的贮备形式，其水解产物可以通过影响人体内分泌或神经来调节人体代谢，改善记忆力等，也是许多疾病形成的化学介质[1,2,3]。磷脂还是一种理想的生物标志物，通过对磷脂组成的研究来揭示微生物生物量、群落的组成和生理状况等信息[4,5,27-31]。磷脂分子结构中既有疏水性的脂肪酸基，又有亲水性的磷酸基，是兼性分子，因此可作为乳化剂、稳定剂、和湿润剂，在工业生产上有重要应用[6]。各种纯度的磷脂作为药物、保健品、食品、添加剂已经在化工、食品、医药等领域推广使用。可见，磷脂在工业生产、食品科学、医药学、生命科学等研究方面都有重要的应用，而对磷脂进行分离、提纯则是各种研究的前提和关键。
     天然磷脂是一类含磷酸的类脂化合物，广泛存在于植物的种子，动物的脑、肝、卵和微生物体中。各种来源的磷脂都是由多种不同分子构型的磷脂分子组成的混合物，并具有差异性，给检测带来一定难度。对磷脂总量测定的方法有比色法、称重法、紫外分光光度法和红外光谱法，对磷脂进行分离、提纯的方法有薄层色谱法、液相色谱、以及核磁共振法[7]，高效液相色谱的优势在于可以避免破坏磷脂分子，减少实验误差，得到更多、更准确的分子结构信息，具有方便、快速、高灵敏度的特点。

2、磷脂的结构组成
     磷脂按照分子结构可分为磷酸甘油酯和鞘磷脂两大类。磷酸甘油酯是脂肪酸、甘油和磷酸结合的衍生物，结构通式如下：

式中R1、R2代表脂肪酸残基，其碳原子数一般在12~18，以偶碳数居多，根据分子中X的不同，磷脂又可分为多种类型，如磷脂酸PA，磷脂酰甘油PG，二磷脂酰甘油DPG，磷脂酰乙醇胺PE，磷脂酰胆碱PC，磷脂酰丝氨酸PS，磷脂酰肌醇PI。

鞘磷脂SM又名神经磷脂，是由神经酰胺与磷酸直接相连，再与胆碱或胆胺连接成酯，结构通式如下：

3、磷脂的高效液相色谱测定
     用高效液相色谱分析磷脂的困难在于磷脂分子的低挥发性、不耐高温、弱紫外吸收、易吸水、稳定性差。而且，不同来源的磷脂组成成分不同，分子中脂肪酸链长度、不饱和度也有差别。在生物体中，磷脂一般与其他的脂类结合在一起，需要化学手段进行分离，纯化、浓缩，才能用色谱测试，且有的磷脂分子如磷脂酰丝氨酸同时存在带相反电荷的基团，更增加了分离和定量的难度。卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂含量较高，相关报道较多见，而含量较低的丝氨酸磷脂则因为检测难度相对较大而较少报道。而且，随着科学研究的深入，更多的一些微量、痕量的生命活性磷脂被发现，这一类磷脂的检测难度更大。
     针对液相色谱检测磷脂存在的一些困难，出现两种解决办法：一是将磷脂分子进行衍生化使其更有利于检测。如通过化学反应使磷脂分子改性，或直接在磷脂分子上连接发色团或荧光基团，用紫外或者荧光检测器进行检测，可大大降低检测限，提高分离选择性[8]。但是衍生化反应过程复杂，前处理步骤繁琐，对定量结果的准确度影响较大，操作繁琐，不能用于磷脂的常规检测。另一种解决办法是针对磷脂的弱紫外吸收特点，可以选择使用非选择型的检测器，如蒸发散射光检测器和质谱检测器，也可实现很好的分离、检测效果，蒸发光散射检测器在磷脂的测定方面具有很大的优势，而质谱检测器，不但可以降低检测限，还可得到分子结构信息，是目前国内外研究的热点。
     测定磷脂的液相色谱法根据所用的固定相不同可分为正相色谱和反相色谱。正相色谱一般以硅胶柱或氰基柱为固定相，流动相有氯仿-甲醇-氨水、正己烷-异丙醇-水以及乙腈-甲醇-水，而反相色谱则多以C18、C8为固定相，流动相为甲醇-乙腈-水或单纯的甲醇。
将文献中各测定条件及结果归纳如下。

表1正相分离磷脂类化合物的方法

表2反相分离磷脂类化合物的方法

    磷脂在正相色谱中的分离是由于各组分分子极性大小不同，流出顺序不同，各组分得到分离。如硅胶柱上，正己烷-异丙醇-水为流动相时，PE极性最小，PC极性最大，PI位于中间，故一般的流出顺序为：PE、PI、PC，当甲醇-乙腈-磷酸为流动相洗脱时略有差别，流出顺序为PI、PE、PC。而反相色谱分离磷脂的原理则是由于各磷脂分子上酰基链的长短不同，疏水性不同，从而在反相柱上的保留时间不同而顺序流出，得到分离。Zhizhong Guan等研究发现乙腈-甲醇-水分离PC较好，正己烷-异丙醇-水分离PE、PC效果较好[9]。

4、国、内外研究进展
    国内用高效液相色谱对磷脂进行分离测定的研究多集中在食品、医药、工业、基础科学等领域。如食品、保健品、血浆、熊胆中的磷脂测定[10-14]。正相、反相色谱方法都有报道，大多用的是紫外检测器[10-14,19,20]，也有蒸发光散射检测器[15]、示差折光检测器[16]及质谱检测器[17,18]的报道，近几年来质谱检测器的使用逐渐增多，对磷脂分子构型的研究已开始起步。马焕文等用高效液相色谱测定血小板中的磷脂成分，用乙腈、甲醇和磷酸作流动相，在硅胶柱上成功分离了PS、PE、PC、SM，回收率都大于90%[20]。用硅胶柱分离主要的磷脂组分，再用反相C18柱分离每一种组分的分子种，可以得到详细的磷脂分子的结构信息，如曹栋等，用HypersilSi60分离了大豆磷脂酰胆碱，然后用C18柱对磷脂酰胆碱分子进行进一步的分离，得到18:2/18:2-PC、18:3/18:3-PC 等5种分子类型，其中18:2/18:2-PC占64%[17]。这一研究结果实现了在分子水平上研究磷脂生物学功能。夏海涛等也用硅胶柱和ODS柱分离了大豆磷脂酰胆碱的分子种，得到11种分子种，其中18:2/18:2-PC占51.2%，含量最高，与曹栋等的研究结果一致[18]。周红等用LichrosovSi60作固定相，甲醇-氨水-水进行梯度洗脱，蒸发光散射检测器进行检测，分离出大豆磷脂的PE、PI、PC、PA[15]。董晓渭等用正己烷-异丙醇-磷酸-水为流动相在硅胶柱上分离大豆磷脂，PC的回收率达102%，峰面积的变异系数为0.5%，线性范围在0.05~4g/L[19]。而何新霞等用硅胶柱作固定相，乙腈、甲醇和水作流动相，PC的线性范围在0.04~0.8mg/mL，回收率98.3%，相对标准偏差6.80%[14]。姜秋芬等用硅胶柱分离大鼠肝过氧化物体膜磷脂，乙腈-甲醇-磷酸洗脱，得到磷脂的检测限分别为CL12ng、PI8ng、PS23ng、PE4ng、PC23ng、SM7ng[13]。王丹侠等对比了Si、CN、C18柱对保健品中磷脂的分离效果，发现PC、PE、PI、SM在CN、C18柱上分离不好，在Si柱上可以得到很好的分离[12]。用反相柱分离磷脂也取得了良好的效果。卢学清等测定熊胆中磷脂类化合物时，发现在PE-C18柱上，甲醇-乙腈-水洗脱时，PC、PG都分出双峰，还出现托尾、肩峰等问题，这是因为同一种磷脂分子含有脂肪酸链的长短、不饱和度不同的分子种[11]。刘宝全等进行了在C18柱上用乙腈-甲醇-水分离蛋黄磷脂的尝试，PC的线性范围在1~5mg/mL[21]。杨亦文等在硅胶柱上对比了紫外检测器和示差折光检测器，发现紫外检测器的结果受磷脂来源的影响比较大，不同来源的磷脂，脂肪酸组成不同对分析结果影响很大，难以实现非常准确地定量。而示差折光检测器则好一点，但是其灵敏度较低，对环境要求高，受温度影响大[16]。
     国外对磷脂的研究涉及更加广泛，如食品、医药、生命科学、地球化学等领域。研究深度和广度上都较国内大。AndreaAvalli 等用固相萃取和液相色谱连用分离乳品中的磷脂成分PE、PI、PS、PC、SM，对比了硅胶和C8固相萃取的小柱，硅胶小柱的回收率要高于C8柱[22]。A.Rodríguez-Bernaldo de Quiros等测定海胆组织中磷脂的组成，加标回收率为PI92.15%、PS93.82%、PE93.44%、PC103.13%、SM95.47%[23]。Maria Fiorenza Caboni等用氨基柱固相萃取牛肉中磷脂，在硅胶柱上用氯仿-甲醇-氨水进行洗脱，蒸发散射光检测器，得到PG、PE、PI、PS、PC、Sph[24]。Duk Hui Kang等研究了不同粒径的柱填料对制备色谱分离磷脂效果的影响，得出颗粒越小，形状越规则，分离效果越好，15µm是理想的制备色谱[25]。Jun Hayakwa等用正相液相色谱和质谱连用，分离出兔子组织中PG、PI、PE、PC、SM、LPC成分，并给出定量方法，实现磷脂分子的定量分析，其中PC的回收率达到90%，含量较低的PS回收率69.3%，其它磷脂组分的回收率在两者之间[26]。
     用高效液相色谱与质谱连用，可以在不破坏磷脂分子结构的前提下，得到更加全面、准确的磷脂分子结构信息，这一点在医药科学、生命科学等基础科学的研究中尤其重要。如Heike Rütters，Jiasong Fang等通过高效液相色谱与质谱的连用对磷脂进行分子机构解析，系统研究了海洋沉积物中微生物群落结构[27-32]。2004年，Klaus-G,Zink 用正相LC-ESI-MS-MS对沉积物中磷脂进行分离与分子结构解析，从而对海洋沉积物中微生物生物量及群落结构进行研究[32]。
     高效液相色谱与质谱连用，用于磷脂分子种类定性、定量分析，是今后磷脂分离、检测技术发展的方向。

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