HPLC－ECD检测羟自由基方法的研究
杨威，邓玉林*
（北京理工大学生命科学与技术学院 北京 100081）

摘要： 本研究采用高效液相色谱结合库仑阵列多电极检测器体系（HPLC－ECD）建立了一套操作简便、高效、快速测定羟自由基的方法，并探究了检测的灵敏性，浓度和响应因子之间的线性关系，系统的稳定性等。2.3-二羟基苯甲酸（2.3-DHBA）、2.5-二羟基苯甲酸（2.5-DHBA）以及水杨酸（SA）的相关系数分别为0.9999、0.9996、0.9968。2.3-DHBA和2.5-DHBA的检测限都低于0.1ng/mL， SA的检测限均低于10ng/mL，各种物质的方法回收率为100.5%－102.9%。
关键词： 羟自由基；HPLC－ECD

A HPLC-ECD method to study hydroxyl free radical
Yang Wei, Deng Yulin*
(Life Science Department, Beijing Institute of Technology, Beijing, 100081)

Abstract: High performance liquid chromatography (HPLC-ECD) was used for measurement of the neurotrasmitters. In our study ,the method of measuring hydroxyl free radicals was established, and we described systematic investigations of various factors involved in contributing to the reliability and reproducibility of the neurotrasmitters measurement. These factors include sensitivity of detection, limits of linear relationship between concentration and the response factor, stability of the system. The response factor of 2.3-DHBA、2.5-DHBA and SA are respective 0.9999、0.9996 and 0.9968. The limit of detection of 2.3-DHBA and 2.5-DHBA are below 0.1ng/mL ,and SA is below 10ng/mL .
Key words: hydroxyl free radicals，HPLC－ECD

投稿日期：2005-6-15
作者简介：杨威（1979年12月），男，汉族，辽宁省沈阳市
联系方式：电话：13811244010，Email：yw587587@bit.edu.cn

    氧化应激是被一个广泛研究的致病因子，有报道认为它与帕金森病的发病机制相关。自由基的大量形成可导致氧化应激，因此通过测定活性氧自由基水平可以在一定程度上反映氧化应激的水平。但在生物样品中自由基的含量非常低、且半衰期短，对其进行直接检测比较困难。水杨酸捕获法是一种较好的检测自由基的方法。其原理是水杨酸与自由基反应生成2.3-二羟基苯甲酸(2.3-DHBA)、2.5-二羟基苯甲酸(2.5-DHBA)和儿茶酚(catechol)如图1，其中，产物2.3-DHBA的生成量与反应的自由基的量成一比一的关系，因此利用高效液相色谱分离并检测2.3-DHBA的含量，从而达到间接测定自由基含量的目的，进而反映氧化应激的水平。本研究通过建立HPLC-ECD的方法来测定羟自由基水平，为帕金森病的致病机理研究提供方法学支持。

1. 材料与方法
1.1 仪器及试剂
     美国ESA公司高效液相色谱仪：包括两台582型恒压微流活塞泵、542型86孔自动进样器、5600A型八通道库仑阵列检测器及配套色谱工作站。
     标准品及试剂：2.3-DHBA、2.4-DHBA和2.5-DHBA标准品购自Sigma公司，水杨酸(SA)等药品购自北京化学试剂公司，甲醇为色谱纯，购自Fisher公司，其它试剂均为分析纯，实验用水为18.2MΩ三蒸水。
1.2 色谱条件
色谱柱：Alltima C18（5μm 150mm×4.6mm）；
流动相：甲醇：三蒸水＝10:90（v/v），缓冲液中含有：45mM的三水合乙酸钠、35mM的柠檬酸、130μM的乙二胺四乙酸二钠和200μM的SHS， pH值为4.0，0.22μm有机膜过滤，真空脱气30分钟；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测电势：－50mv－900mv；进样量：40μL；内标定量法。
1.3 标准样品的制备
    精确称量2.3-DHBA、2.4-DHBA、2.5-DHBA以及SA各a mg，溶解于a mL的三蒸水中制成1mg/mL的月母液；将月母液稀释200倍成周母液（5000ng/mL），将月母液、周母液保存于-4℃冰箱中（月母液的保存期一般不超过一个月；周母液的保存期一般不超过一周）。在测定时将周母液当日稀释成所需浓度即为日标准溶液，2.3-DHBA和2.5-DHBA的浓度梯度为：100、50、10、5、1ng/mL；SA的浓度梯度为100、500、1000、5000、10000ng/mL；内标2.4-DHBA的浓度为50ng/mL。
2. 结果与讨论
2.1 色谱分离条件的选择
2.1.1 流动相配比的选择
    流动相为含有甲醇的45mM醋酸钠(pH 4.0)缓冲溶液，其中甲醇含量在0－30%之间变化，经过多次实验，综合考虑组分保留时间和分离效果，最终选用含10%甲醇的流动相进行实验。
2.1.2 流动相pH值的选择
    以含10%甲醇和45mM醋酸钠缓冲液为流动相，利用柠檬酸调节pH值，试验了不同pH值对各组分保留时间的影响。结果表明pH值对四种组分的保留时间都有一定的影响，为获得各组分较好的保留时间，采用pH4.0进行实验。
2.1.3 工作电势的设定
    以含10%甲醇和45mM醋酸钠缓冲液(pH 4.0)为流动相，工作电势在-50－+950mv之间变化进行实验，最终确定各组分的最佳电势：2.3-DHBA为240mv；2.4-DHBA为420mv；2.5-DHBA为150mv；SA为650mv。
2.2 四种物质的标准曲线、相关系数、精密度及方法回收率
2.2.1 线性范围和检测限
    本系统对于2.3-DHBA和2.5-DHBA在1－100ng/mL有着良好的线性关系；SA在100－10000ng/mL有良好的线形关系。在系统稳定的情况下，2.3-DHBA和2.5-DHBA的检测限均在0.1ng/mL以下，SA检测限低于10ng/mL，结果如表1所示。
2.2.2 标准曲线
2.3-DHBA和2.5-DHBA浓度梯度为：1、5、10、50、100ng/ml；SA浓度梯度为：100、500、1000、5000、10000ng/mL；内标物2.4-DHBA浓度为：50ng/mL。各种标准样品的峰高同内标峰高的比值与浓度进行线性回归，得到回归方程及相关系数如表1所示。

表1 各种标准样品的回归方程、线性范围、相关系数及其最低检出限

2.2.3 精密度与回收率
    从标准曲线上取一个浓度点分别做日内和日间精密度，日内进行5组平行实验、日间进行5组平行实验，结果如表2、3所示；根据各组分的标准曲线计算出各个组分的方法回收率，结果如表4所示。

表2 各种标准样品的日内精密度

表3 各种标准样品的日间精密度

表4 各种标准样品的方法回收率

3. 小结
综上所述，该色谱方法灵敏、快速、且分离效果好，全部4种物质同时分离，其测定时间不到20分钟，方法有着很好的重现性和较高的回收率，且最低检测限低于0.1ng/mL，对生物样品痕量检测提供了一种很好的方法。根据实验的需要，单测一种或某几种物质，这就使其应用范围更广、更灵活。