是否存在SSAO同功酶的研究
王琳，肖盛元，邓玉林*
（北京理工大学 生命科学与技术学院，北京100081）

   SSAO（semicarbazied-sensitive amine oxidases）是一类对氨基脲敏感的氨基氧化酶的通称，它能催化胺类物质转换成相应的醛类并产生过氧化氢和氨。越来越多的研究表明，SSAO含量的变化与糖尿病具有很大的相关性。本实验通过HPLC/MS联用的方法分别检测加入SSAO抑制剂（2－溴乙胺）后正常鼠、糖尿病鼠和糖尿病治愈鼠血清中SSAO的活性，比较该抑制剂在各个血清中的抑制率，发现正常鼠血清中的抑制趋势与其他两种血清不同，初步认为糖尿病鼠中存在着SSAO同功酶，正常鼠一旦患有糖尿病后，其体内的SSAO将发生改变，并且该改变不可逆。

1 实验部分
1.1 试剂和仪器
   2－溴乙胺和异丙基肾上腺素购自Sigma公司。多巴胺购自Fluka 公司。乙腈为色谱纯，购自Fisher公司。其他试剂为分析纯。主要仪器为Agilent 1100 LC MSD Trap MS。
1.2 样品收集
   Wistar大鼠，雄性，购自北京大学医学部实验动物科学部。随机分成3组，分别为正常组，糖尿病组和阳性药组。糖尿病组和阳性药组分别通过streptozocin (STZ, 50 mg / Kg)诱导使其患有糖尿病，阳性药组再以2－甲双胍进行治疗，使其血糖恢复到正常水平。实验期间大鼠自由进食，12h light/dark , 20℃。
   实验结束后取大鼠尾静脉血，于2500 g，4℃冷冻离心20 min，取上层血清做为酶样。
1.3 方法
   色谱条件：Discovery F5-SH柱 4.6 mm×250 mm，5μm，10％（v/v）乙腈/缓冲盐的流动相（pH 4.0），流速0.8 ml/min，进样量20 μL 。
   质谱条件：检测器为MS，ESI源，正离子模式，一级质谱做全扫描，扫描范围160～220 m/z，提取m/z 170的离子流色谱图。雾化气压力为30psi ，干燥气流速为9 L/min 。
1.4 SSAO活性的测定
   标准甲醛溶液中加入40 mg多巴胺，在400μl的0.05 M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中，37℃反应30分钟，PCA终止反应。9mg异丙基肾上腺素做为内标，终体积为500μl 。
   体外血清反应体系为：25mM 甲胺、10μl血清、10mM 多巴胺。加抑制剂组先把2－溴乙胺(1mM) 和酶37℃共培养30 min, 然后再加入底物和衍生化试剂。终止反应后在4℃下17000 g离心10 min，取上清液过滤进样。

2 实验结果
   加入酶抑制剂后，各个血清中SSAO活性都有所降低。比较其抑制百分比（见图1），2－溴乙胺对正常鼠的抑制率比糖尿病鼠和阳性药鼠略高，由多项式分别表示其抑制趋势，糖尿病组和阳性药组的趋势线几乎重合，而正常组的曲线与两者不同。
3 讨论
   众所周知，同一种抑制剂对同一种酶的抑制率是一样的，由多项式曲线可以看出， 2－溴乙胺对糖尿病组和阳性药组老鼠血清中SSAO的抑制趋势几乎相同，而对正常鼠血清中SSAO的抑制趋势与上述两者不同。由此我们可以假设一旦患有糖尿病后，生物体内的SSAO会在某种程度上发生改变，并且该改变不可逆，经治愈后仍无法回复到正常状态，即存在SSAO同功酶。
   本实验还在进一步研究中，预期通过大样本多角度的实验深入论证在糖尿病患者中是否存在SSAO同功酶。若该假设成立，将会对糖尿病的致病机理有了一个新的认识，同时也可从中寻求治疗糖尿病的新的有效的方法。

图1. 2－溴乙胺对不同鼠血清中SSAO活性的抑制率结果

   正常组给水，糖尿病组和阳性药组分别通过streptozocin (STZ, 50 mg / Kg)诱导使其患有糖尿病，阳性药组再以2－甲双胍进行治疗，使其血糖恢复到正常水平。2－溴乙胺为SSAO抑制剂，异丙级肾上腺素为内标。

The investigation of whether has the isodynamic enzyme of SSAO(semicarbazied-sensitive amine oxidases)
Lin Wang , Shengyuan Xiao , Yulin Deng *
a Beijing Institute of Technology, 5 Zhongguancun South Street, Haidian District, Beijing, 100081, China

Abstract. Semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) catalyzes the deamination of methylamine and aminoacetone to produce toxic aldehydes, as well as hydrogen peroxide and ammonia. Many researches indicates that there is a correlation between SSAO and diabetes. In this study, we use a HPLC/MS method to analysis the SSAO activity in rats serum in vitro treated by SSAO inhibitor. Compare the inhibition ratio of SSAO in different serum, we hypotheses that may be exist the isodynamic enzyme of SSAO in diabetic.

Keywords: SSAO, isodynamic enzyme , 2-bromoethylamine hydrobromide, HPLC, MS