甲醛对大鼠血清中SSAO催化的脱氨基氧化反应的影响
王琳，肖盛元，杨嘉明，邓玉林*
（北京理工大学 生命科学与技术学院，北京100081）

   SSAO（semicarbazied-sensitive amine oxidases）是一类对氨基脲敏感的氨基氧化酶的通称，它能催化胺类物质转换成相应的醛类并产生过氧化氢和氨。现有很多测SSAO活性的方法都是通过测定产物中醛类物质的生成量来进行的。在以甲胺为底物测血清中SSAO活性的实验中，生成的大量甲醛可能会对该反应有一定的反馈抑制作用，同时甲醛也可能与血清中蛋白质发生交联，这些都会对活性测定结果造成影响。本试验应用HPLC与MS联用的方法，深入探讨了甲醛对血清中SSAO催化的脱氨基反应的影响，认为甲醛具有对该反应的反馈抑制作用同时可与蛋白质发生交联，为进一步研究SSAO及其与相关疾病的关系奠定了基础。

1 实验部分
1.1 试剂和仪器
   异丙基肾上腺素购自Sigma公司。多巴胺购自Fluka 公司。乙腈为色谱纯，购自Fisher公司。甲胺，甲醛均为分析纯。主要仪器为Agilent 1100 LC MSD Trap MS。
1.2 样品处理
   健康Wister大鼠尾静脉取血，于2500 g，4℃冷冻离心20 min，取上层血清做为酶样。
1.3 方法
   色谱条件：Discovery F5-SH柱 4.6 mm×250 mm，5μm，10％（v/v）乙腈/缓冲盐的流动相（pH 4.0），流速0.8 ml/min，进样量20 μL 。
   质谱条件：检测器为MS，ESI源，正离子模式，一级质谱做全扫描，扫描范围160～220 m/z，提取m/z 170的离子流色谱图。雾化气压力为30psi ，干燥气流速为9 L/min 。
1.4 SSAO活性的测定
   标准甲醛溶液中加入40 mg多巴胺，在400μl的0.05 M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中，37℃反应30分钟，PCA终止反应。9mg异丙基肾上腺素做为内标，终体积为500μl 。体外血清反应体系为：25mM 甲胺、10μl血清、10mM 多巴胺。终止反应后在4℃下17000 g离心10 min，取上清液过滤进样。

2 实验结果
   如图1所示，A为一个典型的色谱分离效果图，SSAO催化的脱氨基氧化反应产物甲醛进一步与多巴胺发生衍生化反应，通过优化pH值等液相条件可以使甲醛与多巴胺反应产物Norsalsolinol达到基线分离，并由质谱检测出来。该方法的最低检测限为2－10 ng / ml 。由图2可知，甲醛浓度为0.05μM时，C大于A，小于A+B；甲醛浓度为50μM时，C小于A。
3 讨论
   A为甲醛与多巴胺反应的结果，B是甲胺为底物加入血清和多巴胺反应的结果，C是A与B反应的加和。理论上说，A加B的值应该等于C，但由实验结果可知，甲醛浓度低时，C小于A加B ，这可能是因为生成的产物甲醛又反过来对该反应有着一定的反馈抑制作用。当甲醛浓度较高时，C反而小于A ，这可能是由于大量的甲醛与血清中蛋白质发生交联反应，而这一反应在甲醛浓度较低时可以忽略不计。由此可知，我们在通过酶反应产物甲醛的量测生物样品中的SSAO活性时，应控制生成的甲醛浓度在一个适当的范围内，使其在各方面对该反应的影响降到最低，从而得到最可靠的实验结果。
 

图1.样品中甲醛的测定原理
（A） 标准溶液的色谱分离结果图 甲醛与40 mg多巴胺在400μl的磷酸盐缓冲液(0.05 M, pH 6.8)中37℃反应30分钟，PCA终止反应。9mg异丙基肾上腺素为内标，终体积为500 μl 。取20 μl 进样。（B）甲醛与多巴胺反应式 (I)为Schiff碱结构的开环中间产物，(II)为闭环产物Norsalsolinol
 

图2. 用HPLC/ MS的方法测Norsalsolinol与异丙基肾上腺素(ISTD)的比值
A：甲醛与多巴胺反应； B：甲胺为底物加入血清和多巴胺的反应； C：A与B反应的加和。甲醛浓度分别为(A)0.05μM(B)50μM，异丙级肾上腺素为内标。

The effect of formaldehyde in the oxidative deamination mediated by SSAO(semicarbazied-sensitive amine oxidases) in rats serum
Lin Wang , Shengyuan Xiao , Jiaming Yang , Yulin Deng *
a Beijing Institute of Technology, 5 Zhongguancun South Street, Haidian District, Beijing, 100081, China

Abstract： Semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) catalyzes the deamination of methylamine and aminoacetone to produce toxic aldehydes, as well as hydrogen peroxide and ammonia. Using methylamine as the substrate to determination the activity of SSAO, the production of formaldehyde might had a feedback suppression to this reaction, moreover, formaldehyde is well known to cross-link proteins, which might had a effect on the reaction. In this study we investigate the effect of formaldehyde in the oxidative deamination mediated by SSAO in rats serum using the HPLC/MS method.
Keywords： methylamine, formaldehyde, SSAO, HPLC, MS