使用浸透限制相的柱切换HPLC法同时测定大鼠血浆中黄芩苷、大黄酸和小檗碱的含量

李奕1，高建平2，许旭1*
（1. 中国科学院上海有机化学研究所 分析测试中心，上海 200032；
2. 上海中医药大学 中药学院，上海201203）
许旭 上海市枫林路354号 中国科学院上海有机化学研究所
电话：021-54925109，54925320 Email: xuxu@mail.sioc.ac.cn

   柱切换技术可以简化样品的前处理步骤，从而实现生物样品的快速和自动化分析。本文的柱切换系统中使用浸透限制相（RAM）Shiseido Capcell Pak MF C8柱来实现药物与血浆母体成分的分离，其硅胶基质的内外表面都键合了亲水性的聚氧乙烯聚合物和憎水性的C8烷基链，使得水溶性生物大分子被阻挡在亲水层之外快速流出，而保留的小分子药物成分则切换至C18柱分析。
   三黄泻心汤出自张仲景的《金匮要略》，由黄芩、黄连和大黄组成，是治疗热盛吐衄症的要方。本文选取黄芩苷、小檗碱和大黄酸为主要的指标药效成分，建立了一种柱切换的高效液相色谱法实现了大鼠血浆中这三种成分的同时测定。

1 实验部分
1.1 柱切换系统 整个系统结构见图1。主要由Waters 486紫外检测器、十通阀(Rheodyne, USA)和两个Waters 510A 泵组成。用HS2000色谱软件（杭州英谱）采集信号。
 

图1 柱切换的HPLC系统 (a) 阀位置A, (b) 阀位置B. 多余的3-7 孔封住。 RAM: Shiseido Capcell Pak MF C8（150 mm×4.6 mm，5 m），AC: 主分析柱, Kromasil C18 （150 mm×4.6 mm，5 m）。

1.2 色谱条件 切换阀在分析开始时处于A位置，RAM柱和分析柱都用各自的 流动相平衡。20 μL离心好的血浆样品直接进入RAM柱去除血浆蛋白及其它干扰物质，此时的流动相为 50 mmol/L中性磷酸盐缓冲溶液－乙腈 (10:1, v/v)。在8 min时将阀切换到B位置，使得包含药物分子的溶剂片断转移到分析柱上。26 min时再将阀切换回A位置，采用20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(三乙胺调pH=6.78)－乙腈 (4:1, v/v)为流动相进行分离。整个分析过程的流速都为1.0 mL /min，254 nm检测。柱温24℃。

1.3 样品制备 体重为249±9克的雄性SD大鼠6只，给药前禁食14 h 以上，自由饮水。按20 mL/kg的剂量喂食三黄泻心汤，于0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、8.0、12.0和24.0 h 尾部取血。1％肝素抗凝，分离血浆，-20℃保存直至检测。检测前再以12000rpm离心5 min。

2 结果与讨论
血浆蛋白及其它极性大分子在6min之前基本能够被完全洗脱出RAM柱。在8min进行阀A向B的切换，不仅排除了血浆内源性物质的干扰也避免了一些非目标化合物（5-8min时间区带内的物质）进入分析柱，从而简化了后续分析。小檗碱在RAM柱上拖尾较严重，因此必须延长阀切换时间保证其完全进入分析柱。
实际分析含药物血浆及空白血浆样品的谱图见图2。
 

图2 Representative chromatogram of plasma obtained 2 h after a 20 mL/kg oral dose (upper) and blank plasma (lower).

   三个指标成分的日内和日间检测精密度是0.34%到4.3%，准确度是98.0%到102.4%，回收率都在95％以上。血浆样品在-20 ℃条件下可保持12天稳定。
   用于实际样品分析，获得了三个指标药效成分的药时曲线。
   结果显示，基于使用浸透限制相的柱切换技术简化了样品的前处理步骤，易于实现生物样品的快速和自动化分析。