非手性柱HPLC法拆分布比卡因对映体
周新1*，于文莲1，白桦1，陈会明1，王超1，郑健2，张青1，陈伟1，马强1
（1. 中国检验检疫科学研究院 工业品检验研究所，北京 100025；
2. 北京市科学技术研究院 北京市理化分析测试中心，北京 100089）

摘要：以β-环糊精和羧甲基-β-环糊精组成的复合环糊精体系作为手性流动相添加剂，利用非手性柱HPLC法成功拆分了布比卡因，确定了最优拆分条件：流动相甲醇:水体积比40:60，20mmol/L磷酸盐缓冲液中含6.0mmol/L的CM-β-CD和2.0mmol/L的β-CD，pH值为6.5，室温条件下，检测波长为220 nm，流速为0.2 mL/min。
关键词：布比卡因；环糊精

   布比卡因是一种应用广泛的麻醉药物，具有局部浸润好、作用时间长的特点，但它的中枢神经和心肌毒性不容忽视。布比卡因结构式如图1所示，左旋布比卡因是布比卡因的S型异构体，它的心肌和中枢神经系统毒性较布比卡因低，两者麻醉效能相似。研究表明[1,2]，局麻药由左旋布比卡因替代布比卡因后，与心肌和中枢神经系统相关的毒性降低。因此布比卡因对映体的拆分是很有意义的一项工作。
 

图1 布比卡因结构式
Fig. 1 The molecular structure of bupivacaine

   范瑞芳等[3]用毛细管电泳法，以羧甲基聚合β-环糊精为手性选择剂成功拆分了布比卡因，但毛细管电泳不具有制备功能，尽管其拆分时间较短，但尚不具有推广价值。
本文采用反相液相色谱法，以β-环糊精和羧甲基-β-环糊精组成的复合环糊精体系为手性流动相添加剂，利用非手性柱成功拆分了布比卡因，此方法与毛细管电泳法以及手性柱HPLC法相比具有操作简便，节约成本和能够制备等优点。

1、实验部分
1.1仪器和试剂
   HP-1100 HPLC系统（美国，Agilent），二极管阵列检测器； C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）（中国，大连依利特）；左旋布比卡因标准品购自中国药品检定所；β-环糊精（β-CD）和羧甲基-β-环糊精（CM-β-CD）购自美国Sigma公司，分析纯；布比卡因消旋药品购自上海医药集团；其余试剂为分析纯；实验用水为高纯水。
1.2色谱条件
   手性流动相甲醇:水体积比40:60，20mmol/L磷酸盐缓冲液中含6.0mmol/L的CM-β-CD和2.0mmol/L的β-CD，pH值为6.5，室温条件下，检测波长为220 nm，流速为0.2 mL/min。所有流动相均经0. 45 µm 微孔滤膜过滤。
   以此色谱条件，用色谱纯的左旋布比卡因进样，得色谱图，从保留时间判定对映体拆分实验中，先流出的峰即为左旋布比卡因，即S型构像的布比卡因。

2、结果与讨论
2.1手性选择剂的选择
   现今通常是利用环糊精作为手性选择剂，采用通常的办法，用单一的β-CD作为手性流动相添加剂，对布比卡因进行拆分，结果并未达到拆分的目的。换用其它不同的β-CD类手性选择剂，仅发现CM-β-CD对布比卡因有拆分作用，将CM-β-CD和β-CD混合加入作为手性选择剂后，分离效果明显改善。故选择此复合体系作为手性选择剂。
2.2手性选择剂总浓度影响
   环糊精的总浓度对手性分离起着重要的作用。令β-CD 和CM-β-CD 的摩尔比为1：1，比较不同的环糊精总浓度下的分离结果（见表1）可知，随着环糊精浓度提高，分离度先升高后降低。环糊精总浓度为8-9mmol/L 时，对映体分离良好。最终选择环糊精总浓度为8mmol/L作为最优条件。

表1 环糊精总浓度对布比卡因对映体拆分的影响
Tab. 1 Influence of Concentration of Cylodextrin

2.3 CM-β-CD 和β-CD的浓度比对分离的影响
   CM-β-CD 和β-CD的摩尔比对分离也具有影响，经实验，分离度随着CM-β-CD 和β-CD的摩尔比增加而增大，最终确定以CM-β-CD 和β-CD的摩尔比为3:1作为分离条件。
2.4 流动相中甲醇的比例对分离度的影响
   20mmol/L磷酸盐缓冲液中加入6.0mmol/L的CM-β-CD和2.0mmol/L的β-CD，以不同比例的甲醇:水为流动相，分离布比卡因对映体，当甲醇:水为40: 60 时，分离度及峰形均为最佳。当水的比例增加时，不但保留时间增加，而且峰形变宽，当甲醇的比例增加时，分离度降低，本文选用甲醇:水为40:60。
2.5流动相的pH 值对分离度的影响
   流动相组成为甲醇:水为40:60，20mmol/L磷酸盐缓冲液中含有6.0mmol/L的CM-β-CD和2.0mmol/L的β-CD，用NaOH分别将其调至不同的pH 值，在前述的色谱条件下分离布比卡因，当流动相pH 值在5.0-6.5之间时，随着pH值的增大，保留时间缩短，分离度由0.86增至1.95；当pH 值> 6.5时，随pH值的增大，分离度逐渐减小；当pH=8.0时，分离度降至0.76。本文选择pH值为6.5作为分离条件。
2.6流速对分离选择性的影响
   试验表明，当流速为0.2mL/min-0.6mL/min时能达到基线分离，当流速大于0.8mL/min时就不能完全达到基线分离。因此本文选择0.2mL/min作为拆分布比卡因对映体的最佳流速。
2.7柱温的影响
   升高柱温，会缩短保留时间，布比卡因与手性选择剂作用时间缩短，导致分离度降低，因此选择室温作为分离条件。
综上，布比卡因对映体的分离条件为1.2所述。以此色谱条件，布比卡因的分离色谱图如图2所示。对映体分离状况良好，左旋布比卡因先出峰，本方法操作简便，分离时间短，较手性固定相拆分法经济，且可推广用于制备左旋布比卡因。
 

图2 布比卡因对映体拆分色谱图
Fig. 2 Chromatogram of bupivacaine

参考文献
[1] Huang YP, et al. Anesth Analg, 1998,86:797
[2] Bardsley H, et al. Br J Clin Pharmacol, 1998,46:245
[3]范瑞芳等. 分析化学, 2003, 31(6):706

High Performance Liquid Chromatographic Separation of Bupivacaine Enantiomers Using Non-Chiral Chromatographic Column
ZHOU Xin*, YU Wen-lian, BAI Hua, CHEN Hui-ming, WANG Chao, ZHANG Qing, CHEN Wei, MA Qiang (Institute of Industrial Product Inspection, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100025), ZHENG Jian(Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis, Beijing Academy of Science and Technology, Beijing 100089)
Abstract: The method of separation of bupivacaine enantiomers by HPLC with β-cyclodextrin and CM-β-cyclodextrin as an additive in the mobile phase was introduced. The premium conditions of resolution of bupivacaine were concentration of β-cyclodextrin 2.0 mmol/L，CM-β-cyclodextrin 6.0 mmol/L, composition and percentage of the mobile phase V(ethanol):V(water)= 40:60，pH=6.5，220nm detection , flow rate 0.2mL/min and room temperature.
Key words: bupivacaine; β-cyclodextrin

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