HPLC与UPLC色谱条件转换方法研究
周新1*，陈会明1，白桦1，于文莲1，王超1，郑健2，张青1，陈伟1，马强1
（1. 中国检验检疫科学研究院 工业品检验研究所，北京 100025；
2. 北京市科学技术研究院 北京市理化分析测试中心，北京 100089）

摘要：以分离分析化妆品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂为内容，对HPLC和UPLC的色谱条件转换方法进行了研究。比较了采取不同方法转换得到的色谱条件参数的分离状况，选出了UPLC法最佳色谱条件。同时，用HPLC法和UPLC法对4种化妆品中的4种对羟基苯甲酸酯类防腐剂含量进行了定量测定，两种方法的测定结果吻合较好，相互印证了方法的准确性。
关键词：超高效液相色谱；色谱条件转换；化妆品；防腐剂

    超高效液相色谱（UPLC）是以1.7μm的超细色谱柱填料为核心技术的新型色谱分离分析技术。该技术自2004年由美国Waters公司推出商品化仪器Waters ACQUITY Ultra Performance LC开始[1]，以其较高的分析速度和分离效率，逐渐在科研工作中有所应用。UPLC对溶剂和样品的颗粒尺寸要求较苛刻，其仪器和耗材的价格较HPLC贵出很多，但其灵敏度较之HPLC并未得到较大程度的提高，单纯的分析时间缩短不能在相应领域内的找到更充分的替代HPLC的应用依据，因此，有关UPLC的应用报道尚不多见。
    本文以分离分析化妆品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂为内容，试着从HPLC和UPLC的色谱条件转换方法方面作出讨论，探讨UPLC在分离分析中的优势与弊端，以期寻找出此项技术的恰当应用范围。

1、实验部分
1.1仪器和试剂
    美国Waters ACQUITY Ultra Performance LC 系统，Waters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；美国Agilent HP-1100 HPLC系统，大连依利特Kromasil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；标准品购自美国Sigma公司；试剂为色谱纯；实验用水为高纯水。
2.2样品处理
    化妆品样品来自送检样品，称取待测样品0.2g置于离心管中，用15mL甲醇分三次提取，每次5mL，超声提取20min，离心10min，将上清液转入25mL容量瓶中，提取完毕后用甲醇定容到25mL用于分析。所有流动相和样品溶液均以0.22μm膜过滤。

2、结果与讨论
   采用HPLC法分离分析四种对羟基苯甲酸酯类化合物的方法较成熟[2]，在此不做重点讨论。而UPLC的色谱条件，是本文讨论的主要内容。
2.1 HPLC法色谱条件
   HPLC法色谱条件为：流动相为70%甲醇＋30%水，流速0.5mL/min，254nm检测，室温，进样体积5μL。分离状况如图1所示。四种物质标准品在10min内实现基线分离，且四种物质各自的线性关系良好。
 

图1. HPLC分离对羟基苯甲酸酯色谱图
Fig 1. Chromatograms of separation of Hydroxybenzoate by HPLC
Peak 1-methyl p-hydroxybenzoate, Peak 2-ethyl p-hydroxybenzoate,
Peak 3-propyl p-hydroxybenzoate, Peak 4-butyl p-hydroxybenzoate

2.2 UPLC法色谱条件
2.2.1直接将HPLC的色谱条件应用于UPLC
    HPLC的色谱条件如2.1所述，将此条件直接应用于UPLC仪器，得到图2-a的分离状况。由图2-a可看出，直接采用HPLC的色谱条件，未能将此四种物质分开，并未达到分离分析的目的。
2.2.2利用Waters的“HPLC－UPLC方法转换计算器”计算色谱条件
   Waters随UPLC仪器提供了一个方法转换计算器软件，该计算器兼顾考虑了UPLC与HPLC分离系统在色谱柱和仪器构造等差异，对流动相、温度、进样量、流速和梯度曲线进行换算，使得HPLC的色谱条件被量化计算成为UPLC的色谱条件，为HPLC－UPLC的方法移植简化步骤，减少工作量。
    此计算器对于等度的HPLC，不会改变流动相的组成和配比，仅对进样量和流速进行换算，经计算所得UPLC色谱条件为：流动相为70%甲醇＋30%水，流速0.62mL/min，进样体积0.2μL。
以计算所得的色谱条件进行标准品分离实验，所得分离效果如图2-b。
    由图2-b可以看出，采用此计算器计算得到的色谱条件，在5min内可以将四种对羟基苯甲酸酯分离开，但对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯的峰稍有重叠，其分离状况不如HPLC好，而且在0.62mL/min的流速下，柱压达到8000psi以上，因柱压较高，会导致色谱柱的寿命缩短等问题，故此方法计算得到的色谱条件不能作为最佳色谱条件。
2.2.3试验得到UPLC的色谱条件
    参考HPLC的色谱条件数据，以及计算器计算得到的结果，建立分离状况更好的UPLC色谱条件。
经试验，在改变流动相配比和流速之后，得到更好的分离效果，最终选择的UPLC的色谱条件为：流动相为50%甲醇＋50%水，流速0.2mL/min，254nm检测，室温，进样体积0.2μL。其分离状况如图2-c所示。

图2. UPLC分离对羟基苯甲酸酯色谱图
Fig 2. Chromatograms of separation of Hydroxybenzoate by UPLC
从图2可以看出，UPLC法在2.2.1、2.2.2和2.2.3这三种色谱条件下，对羟基苯甲酸酯的分离效果差异较大，2.2.3为最优UPLC色谱条件。

2.3 色谱条件改变原因分析
    HPLC与UPLC的最佳色谱条件存在一定的差异，其原因在于色谱柱的不同，色谱柱的尺寸和填料的改变，引起了色谱条件的改变，HPLC的色谱柱填料为5μm的C18硅胶颗粒，柱长250mm，而UPLC的色谱柱填料为1.7μm的C18硅胶颗粒，柱长50mm，并且在硅胶基质中内键合了桥式乙烷基[3]。UPLC的特殊色谱柱，填料小，导致堆积更加紧密，可以在更短的分析时间内达到分离目的，桥式乙烷基使得填料能够承受更大的压力，在较高流速下仍能保持稳定。
   HPLC通常以大比例的甲醇作为流动相，而UPLC因其柱填料密集，大比例的甲醇会导致柱压升高，因此降低甲醇浓度会有利于分离。或者换用乙腈作为流动相，分离效果会更好。
2.4 实际样品检测
    选取送检化妆品4种，分别采用2.1的HPLC方法和2.2.3的UPLC方法对3种化妆品中的对羟基苯甲酸酯类防腐剂含量进行测定。HPLC方法，四种物质的回收率在90.2%-102.7%之间，且5次平行测定的RSD值小于3%；UPLC方法，四种物质回收率在92.5%-98.1%之间，且5次平行测定的RSD值小于2.5%，测定结果见表1。
表1 实际样品检测结果
Tab. 1 Results of sample test

注：— 代表未检出

3 结论
    HPLC法和UPLC法均可作为测定化妆品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂的有效定量分析方法，UPLC法的分离分析时间在4min以内，而HPLC法的分离分析时间在10min以内，且UPLC的样品用量比HPLC少。
    HPLC的色谱条件需经过转换才可以应用于UPLC的实验中，Waters所提供的“HPLC－UPLC方法转换计算器”并不能完全解决方法转换的问题，最佳色谱条件仍需优化。
    高浓度的甲醇容易导致柱压升高，在通常情况下，HPLC色谱条件转换到UPLC色谱条件时，换用低浓度的甲醇会有利于分离状况的改善。

参考文献
[1] Waters. 环境化学, 2005, 24(5):626
[2] 李琛琛, 刘虎威等. 广西师范大学学报（自然科学版）, 2003, 21(3):76
[3] Wyndham, K. D., et al. Anal. Chem., 2003, 75:6781

Study on Transplantation of Chromatographic Process between HPLC and UPLC
ZHOU Xin*, CHEN Hui-ming, BAI Hua, YU Wen-lian, WANG Chao, ZHANG Qing, CHEN Wei, MA Qiang (Institute of Industrial Product Inspection, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100025), ZHENG Jian(Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis, Beijing Academy of Science and Technology, Beijing 100089)
Abstract: Study on transplantation of chromatographic process between HPLC and UPLC by detection hydroxybenzoate preservatives in cosmetics. Compare the chromatographic processes by different methods, choose the best chromatographic process of UPLC. Quantitative determination the hydroxybenzoate preservatives in 4 kinds of cosmetics.
Key words: Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC); transplantation of chromatographic process; cosmetic; preservative

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