HPLC/ESI/MS定量检测丹酚酸B
杨嘉明1、肖盛元1、牟晓玲2、邓玉林1，*
（1.北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081；
2.中国人民武装警察部队学院工程系，河北廊坊065000）

    摘要：建立了高效液相色谱/电喷雾质谱（HPLC/ESI/MS）定量测定丹酚酸B的方法，线性范围在0.5μM-10μM，最低检测限为0.2μM。采用该方法对小鼠腹腔注射丹酚酸B后的血浆浓度进行了测定。该方法具有更高选择性和灵敏度，可对生物样品实现更准确、方便、快速的检测。研究发现，微量的金属锌离子（Zn2＋）有提高丹酚酸B的ESI/MS负离子信号相应的作用。

关键词：丹酚酸B，HPLC/ESI/MS

1．前言
    丹参是唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎，在中医药临床中常用于增加冠状动脉流量[1]，治疗心绞痛[2]，动脉粥样硬化[3]，肝炎和肝硬化[4]等疾病。丹酚酸B是丹参水溶性部分的主要成分，也是丹参的重要药理成分，最近药理研究表明，丹酚酸B除了清除自由基的作用外，还能抗神经毒、保护神经元[5-6]，对心肌缺血 / 再灌注损伤有保护作用[7-8]。
    目前的研究中，对丹酚酸B的高效液相色谱（HPLC）分析测定多采用紫外或荧光检测，而使用高效液相色谱/质谱联用法（HPLC/MS）少见报道。由于生物样品中的丹酚酸B在HPLC检测时不易得到较好的分离，常常需要在流动相中添加多种试剂。有报道[11]采用微柱色谱法检测胆汁中的丹酚酸B，能获得较低的检测限（0.07μM）,但流动相配比复杂，需添加两种有机溶剂及离子对试剂；采用荧光检测丹酚酸B时[12]，检测限低至0.018μM，但荧光强度受流动相背景影响较大[12]，其在生物样品中的检测未见报道。本文采用HPLC/ESI/MS定量测定丹酚酸B，利用离子阱的二次分离功能大大提高了方法的选择性，而且流动相组成简单，具有较高的灵敏度（只与荧光检测法相差一个数量级）。对小鼠腹腔注射丹酚酸B后的血浆浓度进行了测定，方法操作简单，数据准确可靠。

2．实验部分
2.1 仪器与材料
     仪器：Agilent 1100 series高效液相色谱-SL离子阱质谱联用仪，包括微型真空脱气机（G1379A），四元泵(G1311A)，自动进样器(G1313A)，紫外检测器(G1314A)，控温箱(G1316A)，电喷雾离子源。Millipore纯水仪(ZLXS5005Y/ZMQS5VF01)。Heraeus台式离心机（Biofuge22R）。
    材料：甲醇为色谱纯，由Fisher (Fair Lawn, NJ, USA)公司生产；水为超纯水；其他试剂为分析纯，由北京化学试剂公司生产；丹酚酸B由本实验室制备提供（含量>95％）；ICR小鼠购于北京大学医学部。

2.2 色谱条件
    色谱柱：Phenomenex ODS (4.6mm i.d.×250mm, 5um) ；流动相A：1000ppm（w / w）甲酸铵，并含2ppm（w / w）醋酸锌的水溶液，氨水调pH值至7.3。流动相B：甲醇。梯度洗脱程序：0 min 15%B, 20 min 50%B，30min 80%B。流速为0.8 ml / min；柱后分流，分流比4:1。进样体积：60μL。

2.3 质谱条件
    质谱条件为：负离子电喷雾离子化方式；目标离子m/z 717；扫描范围为m/z 667～767；多反应监测（multi-reaction monitor, MRM）信号检测模式，母离子m/z 717，分离宽度±5 amu，但不选择碰撞。雾化气压力为28 psi；干燥气流速8 l/min，干燥温度325℃。毛细管电压为4000V。以m/z717离子的提取离子流色谱图对丹酚酸进行定量。

2.4 样品处理
    动物处理：雄性ICR小鼠共6只，体重在25—27g，随机分组，饲养笼中喂养4天，给药前12小时禁食。按16mg/kg的剂量向小鼠腹腔注射丹酚酸B水溶液0.25-0.27mL，20min后眼眶取血（肝素钠抗凝），4000rpm离心得血浆，-80℃保存备用。
取室温下解冻的血浆200μl，加入200μl的1M盐酸，漩涡混匀1 min，再加入800μl甲醇沉淀蛋白，17000 g离心10 min。取出上清液0.9 ml，室温下N2吹干后，加入300μl的甲醇溶解。17000 g离心5 min后进样60μL。

3．结果与讨论
3.1 实验参数确定
    试验参数优化包括一下三个方面：（1）扫描范围，分别选用一个小的扫描范围m/z 712 ~ 812 (717±5)和一个大的扫描范围m/z 667 ~ 767 (717±50)。（2）数据采集模式，分别选择全扫描模式和MRM模式（MRM信号检测模式，母离子m/z 717，分离宽度±5 amu，但不选择碰撞）。（3）流动组成，水相分别采用在1000ppm（w/w）的甲酸铵溶液以及含1000ppm（w/w）的甲酸铵和2ppm（w/w）醋酸锌的溶液。对上述三种因素进行2个水平的正交试验，丹酚酸B的浓度为5μM，重复3次。对m/z 717的离子的提取离子流色谱图的积分面积和信噪比的平均值进行对比。试验结果如下表1。

表1 不同流动相条件和质谱方法下丹酚酸B的峰面积和信噪比比较（n=3）

注：全扫描1，扫描范围为717±5，信号采集模式为全扫描；全扫描2，扫描范围为717±50，全扫描；MRM 1，扫描范围为717±5，信号采集模式为MRM；MRM 2，扫描范围为717±50，信号采集模式为MRM。

3.1.1 扫描范围对信号的影响
    从表1的实验结果数据中可以看出，扫描范围为717±50时，不论采取全扫描模式还是MRM模式，丹酚酸B的信噪比（112.9, 109.8）均明显优于扫描范围为717±5时的信噪比(27.6, 44.7)。改变流动相的组成时（流动相中加锌离子），大扫描范围下，丹酚酸B的信噪比（131.1，141.5）仍然明显优于小扫描范围下的信噪比（36.5，51.1）。
    一般来说，因为空间电荷效应的影响，离子阱质谱分析实验中，选择较小的扫描范围，可以减少在离子累积过程中其它背景离子的影响，从而减少空间电荷效应，获得更好的信噪比。但在本实验中，选择较小的扫描范围(717±5)，离子的漂移严重，选择一个合适的扫描范围(717±50)可获得更好的信噪比。

3.1.2 信号采集模式对试验结果的影响
    由表1数据可以发现，在小扫描范围下，信号采集模式使用MRM时，丹酚酸B的信噪比（44.7）要优于全扫描模式下的信噪比（27.6），但在大扫描范围下没有显著差异。当在流动相中添加醋酸锌后，无论在小扫描范围还是大扫描范围下，使用MRM模式时的丹酚酸B信噪比（51.1,141.5）均要略优于全扫描模式下的信噪比(36.5,131.1)。由此可见，信号采集模式使用MRM模式可以获得更好的信噪比。

3.1.3 锌离子对丹酚酸信号的影响
    表1的结果表明，在流动相中添加醋酸锌后，在信号采集模式为全扫描时，无论采用小扫描范围(717±5)还是大扫描范围(717±50)，丹酚酸B的信噪比（36.5, 131.1）均要优于不添加醋酸锌时的信噪比(27.6, 112.9)；在信号采集模式为MRM时，也呈现同样的规律。
    在HPLC/MS分析中，实验室常添加毫摩尔量级[9-10]的有机酸盐来提高待分析离子的离子化效率，而本文在此基础上添加微摩尔量级的醋酸锌，发现可以明显提高质谱的离子响应，这说明锌离子的存在有利于提高本实验条件下丹酚酸B的信号响应。

3.1.4 信号响应的稳定性
    从表1中可以看出，扫描范围相同时，在全扫描模式和MRM模式下获得的积分面积的相对标准偏差（RSD％）没有显著差异。较大的扫描范围获得的数据的RSD优于较小的扫描范围，均小于5％，说明本实验条件获得的实验结果有较好的重复性和稳定性。
    一般来说，离子阱进行定量分析时，采用MRM数据采集模式可以获得比全扫描模式更好的检出限，但由于扫描周期较长，数据较分散。本实验条件下，两种模式均可获得精密度较高的实验结果。
    综合上述结果，本实验采用2.2，2.3节所述的色谱条件和质谱条件对丹酚酸B进行定量分析。

3.2 方法学考察
3.2.1最低检测限
    采用该方法对一系列低浓度丹酚酸样品（0.4μM,0.3μM,0.2μM,.0.1μM,50nM）进行检测，确定最低检测限为0.2μM（S/N>5）。

3.2.2线性范围
    在0.5μM-10μM范围内均匀选择5个浓度，通过上述方法进行测定。每个浓度重复进样3次，以样品浓度对色谱峰积分面积平均值进行线性回归，获得丹酚酸B的浓度与信号响应的线性响应曲线y = 12.544x - 4.489，线性相关系数R=0.9990，浓度为0.5μM时S/N平均值为20.9，说明本实验条件下丹酚酸B在该浓度范围内有较好的线性关系。

3.2.3精密度和准确度
    分别选取中浓度（5μM）和低浓度（0.5μM）样品进行测定，重复进样5次。以色谱峰面积的相对标准偏差考察该方法的精密度，以回收率考察方法的准确度。两个浓度下的RSD值分别为2.08%和8.84%；方法回收率分别为91.6%，107.7%，说明本方法具有较好的精密度和准确度。

3.2.4方法的选择性比较
    通过HPLC/ESI/MS联用分析对UV检测和MS检测的方法的专一性和选择性进行了比较。结果如图2。在图2中，（1）和（2）分别为空白血浆和含药血浆在相同条件下的HPLC/UV色谱图。
    图2（1）为空白血浆的和含药血浆的HPLC/UV（280nm）色谱图，箭头指示处为丹酚酸B的出峰位置，可以看出信号响应较弱，而且受到背景的干扰较大。（2）空白血浆和含药血浆的HPLC/MS 的EIC m/z=717.0色谱图，表明丹酚酸B的检测不受血浆背景基质的干扰。两图比较可以看出该方法的选择性明显优于紫外检测。

3.3 生物样品的测定
    按2.4节所列方法进行样品处理后，用本文的HPLC/MS法测定3只小鼠腹腔注射后血浆中的丹酚酸B含量分别为3.27μg/ml，2.22μg/ml，3.48μg/ml，平均血药浓度为2.99μg/ml。

图2 空白血浆的和含药血浆的HPLC色谱图比较
（1）为空白血浆的和含药血浆的HPLC/UV（280nm）色谱图（A为空白，B为含药血浆）
（2）空白血浆和含药血浆的HPLC/MS 的EIC m/z=717.0色谱图（A为空白，B含药血浆）。

4．结论
    通过优化色谱流动相组成和质谱的离子控制条件，本文建立了丹酚酸B的HPLC/ESI/MS定量分析方法，并发现微量的金属锌离子（Zn2＋）能提高丹酚酸B的ESI/MS负离子信号。该方法具有选择性好，灵敏度高，操作简单方便的优点。小鼠血浆样品的检测结果表明，本方法可用于对丹酚酸B进行药物代谢动力学等研究。

参考文献
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