顶空毛细管气相色谱法测定茶多酚中有机溶剂的残留量
刘波平(1,2)*，周妍(3)，罗香(2)，曹树稳(3)，王俊德(1)
(1.南京理工大学化工学院，南京210094；2. 江西省分析测试中心， 南昌 330029；
3.南昌大学生命科学院，南昌 330047)

摘要： 建立了顶空毛细管气相色谱法测定茶多酚中正己烷、氯仿、乙酸乙酯和丙酮四种有机溶剂残留量的方法。并讨论了平衡温度、平衡时间、盐效应对测定的影响。分析结果表明：该方法对上述四种有机溶剂均达到了完全分离，线形关系为0.994~ 0.999,检测限范围为0.065μg/g~0.268μg/g，测定结果的相对标准偏差为0.39% ~ 2.13%，样品的回收率为90.9%~ 105.3%。方法简便、快速、灵敏、重现性好。
关键词： 顶空毛细管气相色谱法；茶多酚；溶剂残留
    茶多酚（Tea Polyphenols，TPs）是茶叶中的主要活性成分，它是一种以儿茶素类为主的多酚类化合物，具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血脂、降血糖、抗龋护齿、抗菌抗炎、抗过敏、增强免疫力和抗紫外线照射等多种保健和药理作用[1,2]。制备茶多酚的方法有溶剂萃取法、离子沉淀法、柱层析法、低温纯化酶提取法、盐析法和超临界萃取法等。现在最常用的就是有机溶剂萃取法，该法是先用水将茶叶中的的茶多酚提取出来，再用正己烷脱色，然后用氯仿萃取除去咖啡碱，最后用乙酸乙酯作主提取剂，丙酮作助提取剂纯化茶多酚。此种制备方法中应用了正己烷、氯仿、乙酸乙酯和丙酮四种有机溶剂，因此这四种溶剂的残留量就成为评价茶多酚质量的一个重要指标之一。
    对于样品中溶剂残留量的分析检测方法有顶空气相色谱法、气液平衡法、二硫化碳萃取法等[9]，目前最常用的就是顶空气相色谱法和固相微萃取-气相色谱法。Rocheleau等人用三种气相色谱法测定药物中的正己烷、丙酮、乙酸乙酯等二十几种有机溶剂[4]；Pharmacia Corporation等人用固相微萃取-气相色谱法测定药物中的十几种有机溶剂[5]；李小平、张似蓉等人电子捕获法单独测定了茶多酚中氯仿的残留量[6]；禹凤英等人用气相色谱法测定了茶多酚中的乙酸乙酯的残留量[7]。但是，目前尚未见同时测定茶多酚中四种有机溶剂的有关文献报道，本文是利用顶空气相色谱法同时测定茶多酚中的四种有机溶剂的残留量，该法准确度高，检测灵敏，方法快速简单，重现性好。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
   气相色谱仪(岛津GC2010)及GC-Solution；顶空自动进样仪（DANNI HSS86.50）；20mL顶空瓶；原料茶多酚；正己烷、丙酮、乙酸乙酯和氯仿均为色谱纯。
1.2 色谱条件
   DB-FFAP毛细管柱（30m×0.25m×0.25μm），柱温60℃，进样口温度200℃，检测器（FID）温度200℃，分流比：30:1，载气（N2）流速40mL/min，尾吹气（N2）流速30mL/min。
1.3 顶空条件
   取5 mL溶液于顶空瓶中，顶空平衡温度为75℃，平衡时间25min，轻微震荡，进样环温度110 ℃，进样环体积1mL，传输管温度110℃。
1.4 贮备液及标准溶液的制备
   分别取30μL正己烷、60μL丙酮、15μL乙酸乙酯和6μL氯仿于50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容配成贮备液，再分别取0.25mL、0.5 mL、1mL、2mL、3mL、4mL的贮备液于50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容配成标准溶液。
2 结果与讨论
2.1 平衡温度
   样品的平衡温度与被测组分的蒸汽压有直接关系。选取某一浓度的标准溶液5mL于顶空瓶中，平衡温度分别为70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，自动进样，结果见图1。由图1可以看出，温度越高峰面积越大，即分析灵敏度就越高，这是由于温度越高蒸汽压越高，顶空气体的浓度越高造成的，但是达到一定温度时某些溶剂的峰面积反而减小，这是由于顶空体系中水汽化，从而减少了气相中被测溶剂的浓度，同时还要考虑温度对样品性质的影响，既要保证样品被测组分的汽化,又要减少挥发性干扰物质，故本方法选择平衡温度为75℃。
 

图1 平衡温度与峰面积关系
Fig.1 Relationship between equilibrium temperature and peak area
(a): 氯仿 chloroform (b): 正己烷 n-hexane
(c): 乙酸乙酯 ethyl acetate (d): 丙酮 acetone

2.2 平衡时间
   平衡时间本质上取决于被测组分从试样基质到气相的扩散速度，不同的样品扩散的速度不尽相同。选取某一浓度的标准溶液5mL于顶空瓶中，平衡时间分别为15 min、20 min、25 min、30 min、35 min，自动进样，结果见图2。由图4可以看出，当平衡时间增大，溶剂的峰面积也增大，当超过25min时，峰面积基本不增加，相对有减小的趋势，综合各因素选择平衡时间为25min较为适合。

图2 平衡时间与峰面积关系
Fig.2 Relationship between equilibrium times and peak area
(a):氯仿 chloroform (b): 正己烷 n-hexane
(c): 乙酸乙酯 ethyl acetate (d): 丙酮 acetone

2.3 盐效应
   在顶空样品体系当中适当加入某种盐，可以改变挥发性组分的分配系数，但是对于非极性组分的影响不大，由于本实验的四种有机溶剂中有强极性和非极性的溶剂，本实验分别用硫酸钠，氯化钠和氯化铵进行实验，结果发现极性溶剂的峰面积明显增大，加入硫酸钠的效应最明显，氯化钠次之。但是，非极性溶剂峰面积减小，正己烷几乎不出峰，这是由于盐效应使得极性溶剂在气相中的浓度增大，同时也抑制了非极性溶剂的挥发，因此本实验不宜加盐。
2.4 线形关系
   量取上述标准溶液各5mL置于顶空瓶中，气体1mL自动进样，测定峰面积，每个浓度平行进样3次取平均值。以各溶剂峰的峰面积（y）对个浓度（c）进行线性回归，结果见表1。
表1 线性范围和回归方程
Table 1 Linear rang and linear regression equation

2.5 精密度
   取5mL贮备液于顶空瓶中，气体1mL自动进样，连续进样5次，计算正己烷、丙酮、乙酸乙酯和氯仿峰面积的RSD分别为：2.13%、0.39%、1.10%、1.50%。
2.6 检测限
   取贮备液适量，分别加蒸馏水逐步稀释，直至其峰高约为噪音的3倍，按公式D=3NW/A计算检测限（D为检测限，N为噪音峰高，W为有机溶剂的进样浓度，A为有机溶剂峰高）。结果各有机溶剂正己烷、丙酮、乙酸乙酯和氯仿的检测限分别为：0.119μg/g、0.19μg/g、0.065μg/g、0.268μg/g。
2.7 回收率试验
   精密称取茶多酚样品0.8g，加入贮备液1mL，气体1mL自动进样；另取一份样品0.8g，加蒸馏水5mL，气体1mL自动进样；同时测定贮备液。根据峰面积比计算回收率，正己烷、丙酮、乙酸乙酯和氯仿的平均回收率分别为： 92.5%、93.1%、105.3%和90.9%。
2.8 样品的测定
   精密称取茶多酚样品0.8g，置于顶空瓶中，加5mL的蒸馏水，气体1mL自动进样，参照标准品气相色谱图（见图3）中各溶剂的保留时间，确定样品中的残留溶剂，根据峰面积计算样品中各个有机溶剂的残留量。结果本品中未检出正己烷、丙酮和氯仿，残留溶剂乙酸乙酯的百分含量的平均值为正己烷4.625μg/g、乙酸乙酯18.125μg/g、丙酮6.125μg/g和氯仿1.125μg/g，样品色谱图见图4。

t/min                                        t/min

图3 四种有机溶剂的GC色谱图图 图4 茶多酚中溶剂残留的气相色谱
Fig.3 GC chromatogram of 4 Fig.4 GC chromatogram of residual
organic solvents organic solvents in TPs
1. 正己烷；2.丙酮；3.乙酸乙酯；4.氯仿

参考文献
[1] Joshua D，Lambert，Chung S，Yang.Mutation Research,523-524 (2003) 201-08
[2 Dorota Majchrzak,Sabine Mitter,Ibrahim Elmadfa.Food Chemistry,2004（88）:447~451
[3] 中国人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典二部.北京：化学工业出版社，2000：附录64
[4] Pharmacia Corporation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，29 (2002) 507~518
[5] Marie-Josée Rocheleau, Mélanie Titley, Julie Bolduc. Journal of Chromatography B, 805 (2004) 77~86
[6] 李小平,张似蓉.宁波高等专科学校学报，2001，3（13）：67~68
[7] 禹凤英,高华，冯明霞等药物分析杂志，1997，17（5）：348~349
Determination of Residual Organic Solvents in tea polyphenols by Headspace Capillary Gas Chromatography
Liu Bo-ping(1,2), Zhou Yan(3),Luo Xiang(2), Cao Shu-wen(3), Wang Jun-de(1)
(1. College of Chemical Engineering, Nanjing University of Science and Technology, Nanjing, 210014, China；2. Jiangxi Analysisting and Testing Center , Nanchang ,330029, China ；3. College of Life Sciences , Nanchang University, Nanchang, 330047,China)
Abstract An analytical method of headspace capillary gas chromatography has been developed to determine the contents of residual organic solvents such as n-hexane, acetone, ethyl acetate and chloroform in tea polyphenols (TPs).The influencing factors such as equilibrium times, equilibrium temperature and salting-out, were discussed. The experimental results showed that the peaks of four organic solvents were completely separated, correlation coefficients 0.994 ~ 0.999, detection limits 0.065μg/g~0.268μg/g, relative standard deviations 0.39% ~ 2.13%, and the recoveries 90.9%~105.3%. The method is effective, quick, sensitive and reproducible.
Key words：headspace capillary gas chromatography； tea polyphenols ； residual organic solvents
 

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