HPLC－荧光检测方法用于MAO酶抑制效果的测定

王珊珊 马培翔 刘燕清 屈锋 邓玉林*
（北京理工大学生命科学与技术学院 100081）

摘要：单胺氧化酶是一种重要的调节神经递质代谢的黄素蛋白，其抑制剂的研究是治疗抑郁症和许多许多神经退行性疾病的热点，本文建立了一种用HPLC－荧光检测器测定单胺氧化酶抑制剂的色谱方法。
关键词：单胺氧化酶，抑制剂，荧光

  单胺氧化酶（MAO,EC 1.4.3.4）是存在于细胞线粒体外膜上的，含有硫氢基的一种黄素蛋白[1]。其在体内的主要功能是催化内源性和外源性单胺类物质（如5-羟色胺，多巴胺和去甲肾上腺素等）代谢[2]。在MAO的作用下，单胺类物质被氧化而产生脱氨基作用[3]：
R-CH2-NH2 + O2 +H2O RCHO + H2O2 +NH3
   单胺类物质在神经系统中主要以神经递质的形式存在，MAO通过氧化脱胺作用调节这些单 胺类物质的含量，从而调节神经递质的代谢，因此MAO活力与抑郁症和许多神经系统退行性疾病和有关，如帕金森症等，对其抑制剂的研究一直是治疗相关疾病的热点。
由于单胺氧化酶可以催化kynuramine（犬脲胺）发生如图1所示的反应[4]，生成可发出荧光的4—HQ ，因此可利用HPLC－荧光检测器来检测4—HQ生成量的变化，从而进一步得出MAO酶抑制剂的抑制效果。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂
   甲酸铵（分析纯，北京市旭东化工厂），甲酸（色谱纯，迪马公司），Kynuramine、4-羟基喹啉均购自Sigma公司，Triton X-100（北京拜尔迪生物公司），Wistar大鼠购自军事医学科学院。
1.2 色谱条件
   Angilent 1100系列四元泵和自动进样装置；Waters 474荧光检测器；色谱柱：ZORBAX ECLIPSE XDB-C18( 2.1×150 mm，5 m)；流动相：甲醇：0.1%甲酸铵水溶液(2575, v/v)，进样量2 L，流速0.2 mL/min，室温；激发波长：315 nm，发射波长：380 nm。

2.结果
2.1 HPLC－荧光检测器检测4-HQ方法的建立
   在1~8umol•L-1之间均匀取点，将4－羟基喹啉（4－HQ）标准品进样得到的峰面积和浓度的关系，用最小二乘法经线性回归，得峰面积（A）与浓度（C）的关系曲线的回归方程式为：
A = 7×107C + 3082.1
相关系数 R = 0.9969。在该关系曲线上选取浓度为2 umol•L-1， 5 umol•L-1， 8 umol•L-1
三个点进行精密度的测量，标准偏差为0.84％（n=5），经日间精密度的测定，三个点的标准偏差分别为4.15％，2.45％，2.35％（n=5）。

图2： A为提取得到的单胺氧化酶的色谱图，B为底物Kynuramine的色谱图，A和B作为空白对照。C图为4-羟基喹啉标准品的色谱图，D为单胺氧化酶与底物Kynuramine反应的色谱图，

2.2酶反应时间的确定
为了便于对实际样品的检测，以从Wister大鼠肝脏中提取到的MAO为研究对象，考察了120 min内酶的反应产物4－HQ与反应时间的关系，用最小二乘法将得到的数据进行线性回归，得到120 min内产物4－HQ浓度与反应时间的方程为：
C＝3×10－4 t＋6×10－5
相关系数R＝0.9969，由此可以看出，在120 min内反应产物是随着反应时间的延长而呈线性增长的，在能满足检测需要的条件下，为了能够尽量缩短反应时间，我们选定60 min作为实验中酶反应的时间。

2.3 经典抑制剂抑制效果的测定
本实验选用治疗精神疾病的常用药物帕吉林(优降宁，pargyline) 和氯吉兰(clorgyline)作为研究对象，考察方法的可靠性。我们将一系列不同浓度的药物加入酶反应体系中，将检测到的4－HQ浓度带入下面的关系式中计算抑制百分比(C0为对照组浓度，C为反应样品浓度)：

经过HPLC－荧光检测器检测，得到如图3所示的抑制百分比和药物浓度的关系：

图3.Pargyline和Clogyline的浓度与抑制百分比的关系图

3. 结论
HPLC-荧光检测器检测单胺氧化酶抑制剂活性的方法与传统的液体闪烁计数方法相比，仪器较为简单，分析速度快，稳定性好，对于MAO抑制剂的进一步研究将是一个有力的补充。

参考文献：
[1]裘月 等，中国药学杂志，1994，29(10): 596~599
[2]Johnston J P. Biochem Pharmacol , 1968 , 17 (7) : 1185～1197
[3]Olanow C W. Adv Neurol, 1993(60): 666
[4]Herbert Weissbach et.al., J. Biol Chem, Vol 235,No 4, April 1960