高效液相色谱在砷形态分析中的应用
张 华, 王英锋, 施燕支
首都师范大学分析测试中心, 北京 100037

摘要 砷与人类的生活息息相关，是环境中存在的1种极为重要的非金属元素。由于不同形态的砷其毒性各不同，因此无论对环境样品、食品、药物还是对人体的体液进行砷的形态分析都是至关重要的。高效液相色谱因具有较高的分离能力而被广泛地应用于砷形态的分离研究中。

主题词 高效液相色谱；As；形态分析中图分类号：O657.3

1. 引言
    砷与人类的生活息息相关，是环境中1种重要的非金属元素。砷在自然界中的丰度排第20位，它存在于沉积岩和熔积岩中，自然界中主要与硫形成矿物形式[1]。在空气、土壤、沉积物和水中的主要砷化物有三氧化二砷或亚砷酸As(Ⅲ)、砷酸盐 As(Ⅴ)、单甲基砷酸(MM-AA)和二甲基砷酸(DMAA)[2]，在海产品中则主要以砷甜菜碱(AsＢ，Arsen-Obetaine)和砷胆碱(AsC，Arsenocholine)形式存在[3~5]。不同形态砷化物的毒性不同，主要砷化物的半致死量LD50(mg•kg-1)分别为：As2O3 34.5，亚砷酸盐As(Ⅲ) 14，砷酸盐 As(Ⅴ) 20，MMAA 700~1800，DMAA 700~2600，AsB >10000，AsC 6500[6,7]。毒性大小顺序依次为As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>As2O3> MMAA> DMAA> AsC> AsB。很显然无机砷的毒性较大，有机砷的毒性较小，其中AsC和AsB常被认为是无毒的。由于毒性不同，不同形态的砷在人体内的转变决定了其致毒和去毒的机理。此外，不同形态的砷化物对农作物生长及产量都有显著的影响[8,9]。因此，无论是对食品、环境样品、还是对人体的体液进行砷的形态分析都是有必要的。
   传统的化学分析方法基本上都是测定样品中待测元素的总量，但是随着科学技术不断发展和人体身体健康的要求，仅测量体系中元素的总量已远不能满足研究该元素在体系中生理、毒理作用的需要。元素的行为效应不仅仅取决于该元素的总量，特定的元素只有在特定浓度范围下或者一定的存在形态下才能对生命系统和生物体发挥作用[10,11]。形态是指某一元素以特定的分子、电子和原子核结构存在的形式，包括同位素、不同价态、无机化合物、有机络合物、有机金属化合物、大分子络合物等[12]。通常，不同形态的同一元素具有不同的生理活性和行为效应，因而形态分析已成为分析化学研究领域的1个热点。
   形态分析通常是测定环境或生物样品中与生命有关的元素，它不同于传统的元素分析。由于样品基体复杂、含量低，使得分析形态比仅仅测定元素的总量要困难得多。这往往需要采取较好的分离技术进行样品预处理，要求其选择性好、分离度高、灵敏度高。

2. 用于砷形态分离的高效液相色谱法
   在环境、材料及生命样品中，基体复杂且元素各形态的含量极低，因此需要对样品进行分离和富集，且处理过程中不能使各形态发生变化。很显然，经典的干法灰化、湿法酸消解以及密闭微波消解等前处理方法都不适宜于形态分析[13]。近年来高效液相色谱分离技术在样品前处理中得以广泛应用。该技术有以下优点：HPLC具有较高分离能力；可通过改变固定相和流动相来获得不同化合物的最佳分离；不同砷形态的分离可在室温下进行，避免了化合物的分解损失而造成测定结果不准确；可分离低挥发性或非挥发性的砷化合物。高效液相色谱分离技术并通过对流动相、柱类型、分离模式等进行优化，以保证分离过程中的待测组分有效溶出且不遭破坏而在元素形态分析方面展现了良好的应用前景[11]。
   各砷化物的性质决定着色谱条件的选择，如柱类型、流动相组成、pH以及分离模式等。其中各砷化物的离解常数(pKa)最为重要。常见砷化物的pKa如下：亚砷酸As(Ⅲ)为9.2；砷酸As(Ⅴ)为2.3，6.8，11.6；单甲基砷酸(MMAA)为2.6，8.2；二甲基砷酸(DMAA)为6.2等[1]。说明这些砷化物在一定pH下均可电离，因此使用高效液相色谱法时，离子交换色谱和离子对色谱是常用的分离模式，根据需要也常选用其他的液相色谱分离模式作为砷形态的分离技术。
2.1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）
   反相色谱[14]是指利用极性流动相和非极性固定相进行的分离。反相键合相柱的柱效高，理论塔板数可达每米五万以上，使得其有较高的分辨率；而且可以通过改变流动相的组成来控制溶质的保留时间，使种类繁多、性能差异很大的物质得到分离；样品经提取、浓缩、定容后不需要进一步的纯化，适用于生物样品的测定；该法特别适用于疏水性物质或者基团的分离；该方法的另一优点是重现性好。
Shibata等[15]用反相高效色谱法，以含有4 mmol•L-1四甲基氢氧化铵和4 mmol•L-1丙二酸的水溶液和甲醇（95.95:0.05 V:V）为流动相，调整pH到3.0分离尿样中的15种砷的不同形态化合物。
2.2 离子交换色谱法 (IEC)
   离子交换色谱分离过程基于带电溶质离子与固定相的相反电荷表面的交换平衡，离子的保留依赖于流动相的pH值、离子强度和离子交换剂的性质[16]。由于As(Ⅲ)，As(Ⅴ)，MMAA，DMAA等砷的化合物随pH的改变化合物形态可呈现电中性、带正电或者带负电，可见离子交换色谱分离模式比较适合砷形态的分离。阴离子交换适合于分离As(Ⅲ)，As(Ⅴ)，MMAA，DMAA及少量AsC，AsB，阳离子交换主要适合于分离AsC，AsB，TMAO，Me4As+[17]。离子交换色谱较多地应用于有机砷分离[18-21]和以共价键结合的砷化合物的分离[20,22,23]。其优点是不会导致在分析过程中形态不发生变化，因为其流动相为水的缓冲溶液，所有的检测在柱后完成[24]。
   韦超等[25]用阴离子交换柱和阳离子交换柱，分别以pH 2.4的吡啶-甲酸溶液和pH 10.2的NH4HCO3-NH4OH为流动相成功地分离了30种中国食用海洋食物中的砷形态。何小青[26]等用10 mmol•L-1的TBAH溶液作为流动相，并用丙二酸调节pH为6.6，无梯度洗脱的离子交换色谱法成功地分离了As(Ⅲ)，As(Ⅴ)，MMAA，DMAA 4种砷化合物。Tersahde[27]采用阴离子色谱柱与阳离子色谱柱串联，用碳酸钠与碳酸氢钠缓冲溶液（pH 9.3），用硝酸进行梯度洗脱，在12 min内同时分离了As(Ⅲ)，As(Ⅴ)，MMAA，DMAA，砷甜菜碱和砷胆碱6种离子。Londeborough[28]等用高容量的阴离子交换柱分离8种阴阳离子和中性分子As(Ⅲ)，As(Ⅴ)，MMAA，DMAA，AsC，AsB，三甲基氧化砷（TMAO）和四甲基砷酸离子（(CH3)4As2+）。
2.3 离子色谱 (IC)
   经典的离子色谱是在离子交换色谱的基础上发展起来的，采用低交换容量的新型离子交换分离柱，其后串接1根高交换容量的抑制柱。离子排斥色谱属于离子色谱，其分离机理利用Donnon排斥效应产生离子排斥而进行分离[29]。砷酸和亚砷酸是弱酸，可用离子排斥色谱分离。离子对色谱的优点是可以用单一的色谱系统区别阳离子、阴离子及中性粒子的形态；特别是对阴离子的形态分析的突出优点，而且在有机物分离分析中存在巨大潜力；该方法所需费用低。
   Butler[30]用离子排斥色谱法，在Bio-Rad有机酸分析柱上，以0.01 mol•L-1的正磷酸为洗脱液，分离了As(Ш)，As(Ⅴ)。
2.4 离子对色谱法（IPC）
   强极性电离型化合物直接用RP-HPLC分离困难，而离子交换色谱和离子色谱又不能同时分离离子型和非离子型样品，将离子对萃取原理引入高效液相色谱所形成的离子对色谱解决了这一问题。用作元素形态分离的离子对色谱通常为反相离子对色谱(IP-RPLC)。用反相键合相离子对色谱法可分离其中各种无机砷和有机砷的形态，如砷在生化和环境物质中的形态现已发现有20多种[11]。反相离子对色谱主要广泛用于极性元素的形态分离中，该方法操作简便、柱效高。
   Thomas[31]用含有0.5 mmol•L-1四丁基磷酸铵的4 mmol•L-1 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液为流动相，用氨水调pH为9.0可分离矿泉水水样中的砷酸盐As(Ⅴ)，亚砷酸算盐As(Ш)，DM-AA，MMAA，AsB，AsC 6种砷形态。Le等[32]用离子对色谱分离了亚砷酸，砷酸，DMAA，MMAA，AsB，AsC，(CH3)4As+等7种砷化物。

3. 总结与展望
   砷为有毒元素，但As毒性和生物重要性都依赖于其化学形态。不同形态的砷，其毒性差别很大，无机砷毒性最大，而砷甜菜碱和砷胆碱相对来说是无毒的。许多海洋生物如蜗牛、贻贝、珠蚌能将大部分有毒的无机砷经砷糖转化为无毒的砷甜菜碱(AsB)，由于砷糖和砷甜菜碱存在于可供人体食用的海洋动植物中，上述化合物毒性研究有利于对危险性作准确的评估。由于砷元素的特殊性和对人体的特殊作用以及随着环境科学的不断发展，砷近年来越来越受到人们的广泛关注，对其在各种样品中形态的分析有待于进一步的研究。
   高效液相色谱是元素形态分离的有效途径，高效液相色谱在分离和测定方面的特点使其在砷的形态分离中已经得到了广泛的应用，为了提高分离能力，分离机理、发展色谱柱技术、探求科学有效的流动相组成、洗脱方式的选择以及不同色谱柱之间的联用都将成HPLC后
的探讨内容。

参 考 文 献
[1] 张普敦,许国旺,魏复盛.分析化学,2001,29(8):971.
[2] Benramdane L,Bressolle F,Vallon J J. J.Chromatogr.Sci.,1999,37:330.
[3] Jack C Ng,Johnson D,Imray P ,Chiswell B,Moore M R. Analyst,1998,123:929.
[4] Lopez Gonzalvez M,Gomez M M,Palacios M A,CamaraC. Chromatographia,1996,43:507.
[5] Shibata Y, Morita M. Anal. Sci.,1989,5:507.
[6] Poison C J,Tattersal R N.Clinical Toxicology. London,England, Pitman,1969.181.
[7] Zhang X,Vanderbiesen V,Cubber A D,Vanholder R.Clin.Chem.,1996,42:1231.
[8] Burlo F,Guijarro I,Carbonell-Barrachina A A,Valer D,Martinez Sanchez F. J.Agric.Food Chem., 1999,47:1247.
[9] Carbonell-Barrachina A A, Burlo F, Valer D,Lopez E,Martinez Romero D, Martinez Sanchez F. J.Agric.Food Chem., 1999,47:2288.
[10] 王小如,孙大海,庄峙厦.中药复杂体系中重大科学问题探讨.厦门:厦门大学出社,1998.60.
[11] 黄志勇,吴熙鸿,胡广林,等.分析化学,2002,30(11):1387.
[12] Joanna Szpunar, Pyszard Lobinski.Fresenius.J.Anal.Chem,1999,363:550.
[13] Mickalke B.Trends Anal.Chem.,2002,21:142.
[14] Van Beek H, Baars A J,Andersen J L. J.Chromatogr,1998,442:345.
[15] Shibata Y,Morita M. Anal.Sci.,1989,5(1):107.
[16] Mikes O. High Performance Liquid Chromatography of Biopolymer and Biooligomers.Elsev-
ier,Amsterdam,1988.
[17] Hymer C B,Caruso J A. Journal of Chromatography A,2004,1045:1.
[18] 严秀平,倪哲明.光谱学与光谱分析,2001,21(2):129.
[19] A H Pan,F Tie,B G Ru, L Y Liand,T Shen.Biomed Chromatogr.,1992,6:205.
[20] L D Lehm and C D Klaassen. Anal. Biochem.,1986,153:305.
[21] A B Solado Cabezuelo,M Montes Bayon,E Blanco Gonzalez,J I Garcia Alonso,A Sanz.Medel.
Analyst,1998,123:865.
[22] Larsen E H,Pritzl G,Hansen S H.J.Anal.At.Spectrom.,1993,8:1075.
[23] Zheng J, Kosmus W. J.Liq.Chromatogr.Rel.Technol.,1998,21:2831.
[24] Smith F C,Chang R C. Critical Reriew in Analytical Chemistry(CRC),1980,9:219.
[25] 韦超,李卫华,张超,等.环境化学.2003,22(3):215.
[26] 何小青,刘湘生,潘元海,等.现代科学仪器,2004,(4):33.
[27] Tersahde P,Pantsar Kallio M.,Manninen P K G. J. Chromatogr.A,1996,750:83.
[28] Londesborough S,Mattusch J,Wennrich R. Fresenius J.Anal.Chem.,1999,363:577.
[29] 周春山.化学分离富集方法其应用.长沙:中南大学出版社,2001,413~418.
[30] Butler E C V. J.Chromatogr.,1988,450:353.
[31] Thomas P,Sniatecki K. J.Anal.At.Spectrom.,1995,10:615.
[32] LE X C,MA M,WONG N A. Anal.Chem.,1996,68:4501.

作者简介：张 华，女，1982年生，首都师范大学分析测试中心硕士研究生