交联牛血清白蛋白的合成及手性拆分性能测试
于亮1 戴荣继1* 佟斌2 邓玉林1
(1. 北京理工大学生命科学与技术学院， 北京100081
2. 北京理工大学材料科学与工程学院，北京100081）

摘要：本文简要介绍了毛细管分离技术，手性识别作用的原理以及手性拆分剂的选择。合成了交联牛血清白蛋白手性选择剂，将该合成产物键合于毛细管内壁，选择色氨酸和苯丙氨酸作为样品，进行电泳分离测试。针对单一牛血清白蛋白作为手性选择剂的电泳分离测试，对比并讨论了两者分离效果的差异。

关键词：手性选择剂，毛细管电泳，手性药物，对映体，拆分

1. 前言
   本实验采用高效毛细管电泳的方法，进行手性药物的分离。高效毛细管电泳基本原理[1]就是在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离[2]。与以往的经典电泳分离法的相比，后者有很明显的不足：所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高，温度影响大。而高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了0.05mm内径的毛细管；二是采用了高达数千伏的电压。使得毛细管产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，电场电压可以很高；电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加。
    选择蛋白质作为手性选择剂主要是由于蛋白具有复杂的三维结构, 可在局部形成手性微环境, 是一种理想的天然手性选择剂。在蛋白质手性选择剂的引入上，采用手性固定相 (CSP) 法[3]。固载化蛋白质[4]可选择性地结合一种对映体，而与另一种对映体没有结合作用，与非手性固定相相比较，手性固定相方式分离时间短，而选择性和分离度相对较高。

2. 实验部分
2.1 仪器与设备
    牛血清白蛋白(Sigma)；3-氨丙基三甲氧基硅烷（Fluka）；异氰酸酯（Fluka）；其它试剂均为分析纯。
    1239—HPCE ANALYSER 毛细管电泳仪 上海通微分析技术有限公司； LGJ 0.5 冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；石英毛细管，60 cm ×50 μm i.d.，有效长度50 cm。河北省永年锐沣色谱器件有限公司。
2.2 交联牛血清白蛋白的合成
    将2g牛血清白蛋白 (BSA) 溶解于50ml 50mmol/l 的硼酸盐缓冲溶液 (pH=8.7，使用四硼酸钠和盐酸配制) 中，然后加入0.25ml乙二醇二缩水甘油醚（EGDE），混合溶液在37℃ 反应4小时，反应液为无色透明澄清的液体。
    反应完成后将反应液冷却到室温，取分子透过量为2500～3500的透析袋40cm，扎紧一端，将反应液灌入透析袋中，扎紧另一端。将透析袋置于水槽中，注入纯净水，并加以缓慢搅拌，大约2～3小时换一次透析袋外的纯净水，直至水槽中的水呈pH中性，用AgNO3检测，水中不含Cl－为止。这样反应液中的盐及其它小分子已被除去。将除盐后的溶液冷冻干燥，得到白色固体即为交联蛋白。
2.3 键合单一蛋白毛细管柱的制备
2.3.1 毛细管预处理
   取60cm长，50μm内径的石英毛细管，用1.0mol/l NaOH冲洗2h以上，再分别用水和无水甲醇顺序清洗各10min，用氮气加热吹干；
2.3.2 氨基毛细管的制备
    取0.1 ml 3-氨丙基三甲氧基硅烷（3-APS）和0.06 ml三乙胺，溶于5 ml干燥的甲苯中，混匀后吸入毛细管，用氮气吹干，放于干燥箱中100℃反应12h以上；
2.3.3 引入目标涂层试剂
    取氨基毛细管柱，吸入5%戊二醛溶液(配于磷酸盐溶液中)，室温反应5h；用磷酸盐溶液冲洗若干分钟后，吸入饱和牛血清白蛋白(配于磷酸盐溶液中)，用氮气吹干，过夜反应，此步操作可重复3～4次；磷酸盐缓冲液洗后，用氮气吹干，备用。（所用的磷酸盐溶液均为pH=7.0，0.1mol/L）
2.4 键合交联蛋白毛细管柱的制备
    预处理部分同上；在第二步氨基毛细管制备的部分，用异氰酸酯代替3-APS，即可省略添加戊二醛处理部分而直接将毛细管内壁氨基化；引入目标涂层试剂部分，吸入饱和交联牛血清白蛋白（配于磷酸盐溶液中）作为涂层，参与键合反应。

3. 结果与讨论
3.1 数据处理
     tR（保留时间）：即试样从进样开始到出现色谱峰极大值时所经历的时间；
     Y（基线宽度）：即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距；
     α(相对保留时间): 指相邻两色谱峰保留值之比，即α＝tR2/tR1
     Rs(分离度): 指相邻两色谱峰保留值之差与两峰底宽平均值之比，即
     Rs＝2(tR2－tR1)/(Y1+Y2)
    一般来说，当Rs＜1时,两峰总有部分重叠；当Rs=1时，两峰能明显分离；Rs＝1.5时，两峰已完全分离。当然，更大的Rs值，分离效果会更好，但会延长分析时间。
3.2 手性选择剂对分离的影响
     蛋白质作为一种天然的手性选择剂可以用于毛细管电泳的手性分离，但由于其本身具有很强的紫外吸收能力，添加在缓冲液中会对产物的检测起到干扰作用，所以本实验以交联的方式将蛋白质固定在石英毛细管内壁上。选取两种氨基酸，色氨酸和苯丙氨酸作为比较常见的单一位点的手性对映体进行拆分效果的对比，分子结构如图1、图2。

图3，苯丙氨酸电泳分离图，检测波长214nm
A1：键合单一蛋白的手性毛细管柱，20 mmol / L 的磷酸盐缓冲液, pH=3.96, -20.0kV, 分离度Rs=0.30，相对保留时间α=1.10
B1：键合交联蛋白的手性毛细管柱，20 mmol / L 的磷酸盐缓冲液, pH=7.0, -20.0kV, 分离度Rs=1.20，相对保留时间α=1.08

图4，色氨酸电泳分离图，检测波长214nm
A2：键合单一蛋白的手性毛细管柱，20 mmol / L 的磷酸盐缓冲液, pH=5.46, -20.0kV, 分离度Rs=0.50，相对保留时间α=1.14
B2：键合交联蛋白的手性毛细管柱，20 mmol / L 的磷酸盐缓冲液, pH=5.46, -20.0kV, 分离度Rs=0.74，相对保留时间α=1.01

     由图3、图4可见，在相同的色谱条件下，内壁键合交联蛋白的毛细管柱比键合单一蛋白的毛细管柱针对某些手性药物如苯丙氨酸、色氨酸的分离效果要明显得多，分析原因如下：
     使用单一的蛋白质，其生理活性保持的很好，这样在使用的过程中由于难免造成的涂层蛋白质脱落，会干扰所分析物质的检测；交联蛋白的手性作用位点比单一蛋白要多，与消旋体结合的比较充分，故手性选择拆分性能也要好很多。

4. 结论
    用化学键合的方法合成了交联蛋白，作为新型的手性选择剂，通过实验证明具有一定的手性拆分能力，可应用于毛细管电色谱和毛细管电泳等微分离实验中。

参考文献：
[1] 陈义. 毛细管电泳及应用 [M]. 北京:化学工业出版社, 2000.
[2] Wistuba D, Schurig V. Enantiomer separation of chiral pharmaceuticals by capillary electrochromatography [J]. J Chromatogr A, 2000, 875(1-2): 255~276.
[3] Mayer S, Schuring V. Enantiomer separation by electrochromatography in open tubular columns coated with Chirasil－Dex [J]. J. Liq Chromatogr, 1993, 16 (4): 915～931.
[4] 叶明亮,邹汉法. 吸附蛋白质固定相电色谱手性分离的研究 [J], 色谱, 2001, 19(5): 390～394.