食品中非法添加剂苏丹红的HPLC/DAD/MS
分离分析方法研究
孙文通[1]，冯 雷[1]，张承聪[2]，肖 涵[2]
（1、云南省产品质量监督检验中心，云南 昆明，650223；2、云南大学化学系，云南 昆明，650091）

摘 要：本文研究了一种针对食品中非法添加剂苏丹红的分析方法，采用固相萃取技术对样品进行前处理，然后用HPLC对苏丹红样品进行分离，DAD和MS进行串联检测。提高了分析检测的准确性、可靠性。本方法灵敏度高，具有较高且稳定的回收率，精密度较好。分析应用结果令人满意。
关键词： 苏丹红 HPLC/DAD/MS 分析

   苏丹红Ⅰ–Ⅳ（SudanⅠ–Ⅳ）是一类化学合成的偶氮苯染色剂，作为工业染料常用于蜡、地板涂料等化工生产中，但禁止用于食品添加剂 [1，2] ,其结构见图1。由于苏丹红溶液呈橙红色至深红色，不法厂商常将其添加到含有辣椒成分的调味料中，以减少食用色素的投入，增加食品着色的鲜艳程度。苏丹红在食用后，能分解成胺类化合物，据英国联邦危险品管理局（Federal institute for Risk Assessment, BFR）测试，长期低量摄入苏丹红，即具有潜在的致癌作用[3]。自2003年5月9日， BFR宣布在从印度进口的辣椒粉原料中检出苏丹红以来，英、美、德各国已宣布有五百余种产品含有苏丹红染料并将这些产品强制下架[4]。我国迄今为止，检出含有苏丹红的食品共一百余种。由于苏丹红为非法食品添加剂，检验结果为阳性即可判定为违禁，因此，研究开发权威、有效、可靠的苏丹红定性定量分析方法具有重要意义，对食品安全问题具有积极的作用。

图1.苏丹红染料结构图
Tab.1 The chemical structure of Sudan dyes

   目前，分析食品中非法添加剂苏丹红的主要方法为高效液相色谱法[5]，国标GB/T 19861-2005[6]也采用液相色谱法，该法利用高效液相色谱对含苏丹红的样品进行分离，然后用紫外检测器进行分析。但是只利用紫外检测器进行定性时容易出现假阳性结果，直接影响质检部门对苏丹红样品的判断。本文研究并建立了一种针对苏丹红Ⅰ–Ⅳ的高效液相色谱/二极管阵列紫外检测器/质谱（HPLC/DAD/MS）分离分析方法，用HPLC对可能含有苏丹红的食品样品进行分离，然后用DAD和MS两种检测器进行串联检测。本方法可以对食品中的非法添加剂进行准确的定性和定量分析。

1. 实验部分
1.1仪器及工作条件
    日本岛津公司LCMS－2010A液相色谱-质谱联用仪,其中包括LC-10ADvp二元泵,DGU-12AM真空脱气机, SIL－HTc自动进样系统,CTO-10ASvp柱温箱,SPD-M10Avp二极管阵列检测器，LCMS－2010A质谱检测器。分析色谱柱为日本岛津Shim－pack VP－ODS C18 150×2.0mm。色谱工作站为日本岛津公司LCMS Solution色谱工作站。OHAVS－Explorer分析天平，BRANSON－1210超声波水浴，振荡摇床，0.45μm有机相微孔滤膜。经优化的仪器工作条件如下：
色谱条件：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％(v/v)醋酸水溶液，流动相梯度见表1，流动相流速为0.5mL/min，柱温30℃，进样量10μL，DAD扫描波长范围370-800nm，检测波长为478nm。
    质谱条件：LC/MS接口为电喷雾接口（ESI）正离子模式，离子监测模式为选择离子扫描模式（SIM），选择监测各组分的准分子离子峰（[M+H]+），所选择的离子（m/z）分别为249.10（Sudan I）， 277.10（SudanII）， 353.20（Sudan III）， 381.20（SudanⅣ）。喷雾口电压1.5kV，喷雾气和干燥气为氮气，喷雾气流速1.50L/min，干燥氮气（反吹）压力为0.2MPa，CDL电压：－10.0kV，CDL温度：250℃，模块温度200℃。

1. 2试剂
    苏丹红Ⅰ—Ⅳ号固体标准样品（沈阳市试剂工厂），乙腈（色谱纯，德国MERCK公司），丙酮（色谱纯，美国TEDIA公司），正乙烷（色谱纯，美国TEDIA公司），超纯水（18.2MΩ/cm，昆明物理研究所），冰醋酸（分析纯），无水硫酸钠（分析纯），碱性氧化铝（分析纯），氮气（昆明梅塞尔公司）。
    流动相B的配制：使用1mL移液管取1mL冰醋酸溶于适量水中，定容至1L后用0.45μm的滤膜过滤并用超声波脱气后备用。
氧化铝层析柱[7]：用1cm（d）×5cm（h）的注射器管口塞入小片脱脂棉，湿法装入520℃下活化4h的中性氧化铝（100~200目）约1.5g，再加入约1cm高的无水硫酸钠，用10mL正乙烷洗净柱中杂质后备用。

1. 3 标准溶液的配制
准确称取苏丹红Ⅰ—Ⅳ号标样各50.0mg，以乙腈溶解并定容至100mL后制成混合标准储备液，浓度为500μg/mL。取混合标准储备液5mL,以乙腈定容至100mL，成为浓度为25μg/mL的混合标准母液。分别取混合标准母液各1mL，2mL，5mL，10mL，20mL以乙腈稀释并定容至50mL，得到浓度为0.5μg/mL，1μg/mL，2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL的苏丹红标准溶液。

1.4 样品前处理
    称取适量样品（粉状调味品0.5~5.0g，油状调味品0.5~5.0g，含水量较大的食品10.0g）于具塞三角瓶中，加入30mL正已烷，振荡25min后，滤出上清液，用正已烷洗涤残渣数次至残渣洗涤液无色，合并洗液，与滤液一同以无水硫酸钠干燥后，上柱，待样液完全过柱后，以正已烷洗脱杂质与油性成分直至洗脱液无色，换用干净收集容器，再以正乙烷:丙酮＝4:1为洗脱液洗下苏丹红。至洗脱液无色时，收集洗脱液，水浴浓缩至干，以5mL丙酮:乙腈＝1:1定容，用0.45μm有机相滤芯过滤后注入样品瓶。

2.结果与讨论
2.1标样和样品的DAD和MS检测信息
    标样色谱图及MS选择离子监测图(MF)和质量色谱图(MIC)见图2,图3和图4。样品色谱图及MS质量色谱图(MIC)见图5和图6。从以下图中可以看出，本方法色谱条件较好，各组分完全分离，目标物与干扰物质能较好地被分离。比较图3和图4可以看出，在LC/MS中，单一离子的质量色谱图信噪比更高，而且其他组分的干扰更小，因此用LC/MS分析时，一般用质量色谱图来进行定性和定量。在试验中发现，若只以色谱保留时间作为定量依据，容易出现假阳性结果，若以二极管阵列检测信息（色谱保留时间、样品紫外吸收光谱）和质谱检测信息（选择离子监测图、质量色谱图以及质谱图等）联合定性，则可排除假阳性检测结果，使定性结果准确、可靠。
 

图2.苏丹红标样色谱图
Fig.2 The chromatography of Sudan dyes standard

图3.苏丹红标样选择离子检测图
Fig.3 The MF of Sudan dyes standard

图4. 苏丹红标样质量色谱图
Fig.4 The MIC of Sudan dyes standard

图5.苏丹红样品色谱图
Fig.5 The chromatography of Sudan dyes sample

图6. 苏丹红样品MIC图
Fig. 6 The MIC of Sudan dyes sample

2.2定量标准曲线和相关系数
    按1.3所述方法配制标准工作溶液并进样10μL，用DAD和MS串联检测，以DAD所得到的色谱图和MS得到的质量色谱图作为定量依据，用外标标准曲线法进行线性回归得到标准曲线方程和相关系数。由DAD和MS所得到的外标标准曲线方程及其相关系数见表2和表3。曲线方程中X为待测物浓度，Y为待测物峰面积。从表2和表3可以看出，DAD所得到的标准曲线方程的相关性优于质谱，说明在苏丹红的定量分析中，DAD的相关性比MS好。

3.3方法的最低检测限、回收率和精密度
    按一定比例稀释苏丹红标准样品并进样，当实测值与真实值偏差10％时的标准溶液浓度即为检测限，两种检测方式的检测限见表4。在实际样品中以两个水平加入标准溶液，每个水平做5次平行试验，得到平均回收率及相对标准偏差见表5。从表4可以看出，质谱是一种灵敏度更高的检测方法，除苏丹红一号外，其他苏丹红在质谱中的检出限均比二极管阵列低一个数量级。而精密度方面，在检测苏丹红时，质谱的精密度低于二极管阵列，这可能是因为苏丹红样品在ESI接口中的雾化效率和离子化效率不稳定有关。
    实验中发现，固相萃取小柱是影响回收率的主要因素。若碱性氧化铝未活化，则苏丹红会随正己烷洗脱液流出，回收率小于50％。当活化氧化铝的用量大于2g时，苏丹红一号和三号很难被洗脱，回收率低于30％，二号和四号的回收率在90％－98％之间；当活化氧化铝的用量小于于1.1g时，情况正好相反，苏丹红二号和四号在正己烷洗脱时就流出固相萃取柱。因此试验中活化氧化铝的用量为1.5g。

3.4 实际样品检测结果
    按照本文所述方法对苏丹红实际样品进行分析，部分样品的MS定量结果见表6。

   本方法采用固相萃取技术对苏丹红样品进行前处理预分离，用高效液相色谱进行分离，二极管阵列检测器和质谱检测器串连检测。由于本方法采用了DAD和MS串连检测，能够排除假阳性检测结果，能够对可能含有苏丹红的样品进行准确、可靠、权威的分析检测。目前此方法已经用于食品添加剂苏丹红的分析检测。

参考文献
[1] M.S.Reisch, Chem.eng.news 66(1988) 7.
[2] Color Index, Society of Dyes And Colorists [M], third ed., 1971
[3] IARC Monographs on the Evaluation of the Careinogenic Risk OF chemicals to Man [J], Vol.8, IARC, Lyon, 1975,p.125.
[4] Food Standards Agency: Http://www.food.gov.uk.
[5]王春燕，潘炜等，食品中苏丹红染料的检测方法-高效液相色谱法。
[6] GB/T 19861-2005 食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法。
[7] 卢大用，曹静懿等 ，现代层析技术在食品分析中的应用[J] ，食品科技，1997，

The HPLC/DAD/MS analytical approach development of illegal Sudan dyes residues in food
SUN Wen-tong1, FENG Lei1, ZHANG Cheng-cong2, XIAO Han2

Abstract: This thesis concerns about a new analytical approach development of Sudan dyes in food. Solid Phase Extraction was used as pretreatment method. After separated by HPLC, PDAD was combined together with MS as detectors in series to enhance reliability of analytical results. The pretreatment is efficient. The analytical approach has highly sensitivity and the precision is acceptable. So, this new analytical approach has referable value.
Key words: Sudan dyes, HPLC/DAD/MS, analysis