高效液相色谱法测定人血清中25-羟基维生素D3的含量
许蕴 马经野 付林 史敦云 王晓丽 曾丽娟
深圳市第二人民医院中心实验室，深圳（518035）

[摘要] 目的：建立HPLC测定人血清中25-羟基维生素D3浓度的方法。 方法：移取血清，加入乙腈乙醇混合溶液及二氯甲烷正己烷混合溶液，旋涡混合、离心，分离正己烷层氮气吹干，残渣用流动相溶解后进行HPLC分析。色谱柱为XTerra® MS C18 5um, 4.6mmx250 mm，流动相为甲醇∶乙腈∶水（78∶10∶12）；流速1mL/min；柱温30℃，紫外检测器在265nm检测。 结果：25-羟基维生素D3保留时间为10.63min，浓度线性范围25 ~400μg•L－1，R2=0.9992，方法回收率大于90 %，（RSD＜5%），最低检出浓度2μg•L－1(0.04ng，S/N>3)； 30例儿童血清25-羟基维生素D3平均值为30.8±18.2μg•L－1。结论： HPLC检测血清25-羟基维生素D3浓度的方法灵敏度高，回收率和重现性良好，操作快速、简便。
[关键词] 25-羟基维生素D3，血清，HPLC

25-羟基维生素D3是反映体内维生素D营养状况的最佳指标[1]。建立有效、简便的方法检测血清25-羟基维生素D3的含量，在临床应用上有实际意义。本研究在文献基础上，优化了样品前处理方法及色谱条件，建立了反相高效液相色谱测定人血清中25-羟基维生素D3浓度的方法，提高了灵敏度，操作简单、快速，结果重现性好，适于临床检测应用。具体方法报告如下。

1 仪器与试药
1.1仪器 Waters alliance 2695型高效液相色谱仪，Waters 2487型紫外检测，SG超纯水机，BESEP氮吹板，低速大容量离心机，旋涡振荡器。
1.2试药 甲醇、乙腈为色谱纯；其它试剂为分析纯；超纯水电导率为18.2MΩ；高纯氮气；25-羟基维生素D3为Sigma公司产品，色谱纯，批号为112K1452。

2 方法与结果
2.1方法
2.1.1色谱条件 XTerra® MS C18 5um, 4.6mmx250 mm色谱柱， XTerra® MS C18 5um, 4.6mmx20mm预柱，柱温30℃；流动相为甲醇∶乙腈∶水（78∶10∶12）；流速1mL/min；检测波长265nm；进样量20μL。
2.1.2标准溶液的配制 精确称取25-羟基维生素D3标准品，用甲醇配成浓度为 10mg•L－1 的储备液，于－20℃冰箱保存。测定前移取储备液用甲醇稀释成系列工作液，浓度为25，50，100，200，400μg•L－1。
2.1.3血清25-羟基维生素D3浓度的测定方法 取血清200μL置试管中，加入乙腈∶无水乙醇(50∶50)混合溶液1mL，再加入碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲溶液200μL，旋涡混合1min，加入30%二氯甲烷正己烷溶液1mL，旋涡混合1min，以3000r•min－1离心3min，移取二氯甲烷正己烷层置于试管中，氮气吹干溶剂，残渣用200μL流动相溶解，按照2.1.1的色谱条件进行HPLC分析，25-羟基维生素D3与血清内源性杂质分离良好，杂质不干扰分析。样品处理的操作可在30min内完成。
2.1.4线性关系与灵敏度 取25-羟基维生素D3系列工作液，按照2.1.1的色谱条件做HPLC测定，以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归。回归方程为y=103x+364，R2=0.9992，在25~400μg•L－1范围内线性良好；以信噪比大于3的浓度作为检出限，进样量为20μL，检出浓度为2μg•L－1，故最低检出量为0.04ng。标准曲线如图1。

图1 25-羟基维生素D3标准曲线
Fig.1 The Calibration curve of 25-(OH)D3

2.2结果
2.2.1色谱行为 上述色谱条件下，在265nm检测25-羟基维生素D3的标准品溶液及血清样品，25-羟基维生素D3的保留时间为10.63min，血清样品中的25-羟基维生素D3与血清内源性杂质分离良好(见图2、图3)。

图2 25-羟基维生素D3标准品色谱图
Fig.2 The Chromatogram of 25-(OH)D3

图3 血清样品色谱图
Fig.3 The Chromatogram of serum sample

2.2.2方法回收率 取混合血清，分别加入不同浓度的25-羟基维生素D3标准工作液，使之含25-羟基维生素D3标准品浓度为25、100、400μg•L－1，每种浓度的血清配制5份，按照 2.1.3所述方法操作，测定加标血清的浓度CX及空白血清的浓度C0，提取回收率=(Cx－C0 )/ Cs ×100%（Cs为所加入标准品的浓度），回收率结果见表1，25-羟基维生素D3平均回收率大于90%，平均RSD＜5%。

表1. 方法回收率 (n=5)
Tab 1. The Recoveries of 25-(OH)D3 added to sample (n=5)

2.2.3精密度 取混合血清，分别加入 25-羟基维生素D3工作液，配制高、中、低3种不同浓度的血清样品，含25-羟基维生素D3标准品的浓度为25、100、400μg•L－1，每种浓度血清配制5份,测定日内差，每天配高、中、低三种不同浓度的血清样品，连续作5天，测定日间差。25-羟基维生素D3血清3种浓度的日内RSD分别为3.53%，4.89%，4.24%（n=5），日间RSD分别为3.88%，4.63%，5.41%（n=5）。
2.2.4 稳定性试验 取混合血清，分别加入 25-羟基维生素D3工作液，配制高、中、低3种不同浓度的血清样品各6份。按2.1.3所述方法，其中1份立即处理、测定；3份于室温下分别放置1h，2h，4h后处理、测定；另外2份置于－20℃冰箱中密封保存，分别于冻藏2周及3月时取出样品解冻，然后处理、测定。结果血清样品中25-羟基维生素D3浓度的变化均小于5％，说明血清样品在－20℃保存3月稳定。
2.2.5 30例儿童血清25-羟基维生素D3的检测结果 用本文方法测定了30例儿童血清25-羟基维生素D3的含量，结果见图4。30例儿童血清25-羟基维生素D3平均值为30.8±18.2μg•L－1。

图4、30例儿童血清25-羟基维生素D3含量散点图
(fig 4. Concentration chart of 25-(OH)D3 in children’ serum)

3 讨论
       应用液相色谱法对人血清中25(OH)D3含量进行定量检测的关键是使血液中的25(OH)D3和与之紧密结合的血清蛋白分离，文献报道有固相萃取、液-液萃取等方法。固相萃取虽然简便，但是作为临床标本检测使用，成本高且回收率偏低，由于血清中25-羟基维生素D3的含量较低，因此我们采取液-液萃取的方法，同时加入缓冲溶液释放与蛋白结合的25-羟基维生素D3，可以获得较高且稳定的回收率。所建立方法的灵敏度达到了国外文献[1]报道的2μg•L－1(0.04ng)，远远高于国内文献[2]报道的80μg•L－1的水平。
       采用氮气吹干萃取液，流动相溶解残渣的方法，同时优化色谱条件，在所有组分分离良好的情况下，缩短了标本处理、分析时间，用目标分析物的标准品作外标，选择25-羟基维生素D3吸收最强的波长265nm作检测，避免了血清内源性杂质对目标分析物的干扰，大大提高了灵敏度，不仅可以满足生理条件下人血清25-羟基维生素D3浓度的检测，同时为病理条件下（如佝偻病患者）25-羟基维生素D3血液浓度的检测或更低含量的研究提供了可行的方法。血清25-羟基维生素D3的浓度作为佝偻病的早期诊断指标[3]，对判定佝偻病的病期有极大的临床意义。
       采血后将血样离心分离，密封冻存于－20℃冰箱中备检。在此条件下储存的血清样品，3个月内稳定，结果重现性良好。

参考文献
[1] Michael Vogeser, Apostolos Kyriatsoulis, et al. Candidate Reference Method for the Quantification of Circulating 25-Hydroxyvitamin D3 by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J Clinical Chemistry 2004;50(8):1415~1417
[2] 徐军,张慧芬,王珏. HPLC法测定血中25-羟基维生素D3的含量 [J] 儿科药学杂志2001,7(1):11~12
[3] 张辉,任萍,陈连元 血清25-羟基维生素D3对佝偻病的诊断价值 [J]. 中国公共卫生1996,12(10):459~460

Determination of 25-Hydroxy-cholecalciferol in human serum by HPLC
Xu Yun, Ma Jingye, Fu Lin, Shi Dunyun, Wang Xiaoli, Zeng Lijuan
The Central Laboratory of Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035

Abstract Objective:To establish a HPLC assay for the determination of vitamin 25-Hydroxy-cholecalciferol in human serum and evaluate the nutritional value of the body’s of 25(HO)D3. Method: The serum was extracted with n-hexane after the protein in the serum was deposited with acetonitrile /alcohol. The layer of n-hexane was evaporated to dryness under nitrogen, and the residue reconstituted in appropriate volume of mobile phase as required. 25(HO)D3 was separated on XTerra® MS C18 5um, 4.6mm x 250mm column, ,and determined at 265nm with UV detector. Using methanol / acetonitrile / water(78/10/12) as mobile phase when the column temperature is at 30℃. Results: The linearity range of calibration curve of 25(HO)D3 is 25 ~400μg•L－1 (R2=0.9992). The average extracted recovery is better than 90%, RSD＜5%. The detection limit of 25(HO)D3 is 0.04ng (S/N>3). The time of sample preparation less than 30 minutes. Conclusion: The method is sensitive, rapid, accurate and simple. It’s suitable for the clinical examination.
Keywords: 25-Hydroxy-cholecalciferol, serum, HPLC