S-萘普生印迹整体柱的电色谱手性拆分机理研究*
刘照胜1 徐艳丽3 高如瑜2 闫超4
1天津医科大学药学院，天津，300070
2南开大学元素有机化学研究所，天津，300071
3南开大学泰达生物技术学院，300457
4Unimicro Technologies. Inc.,4713 First Street,Pleasanton,CA 94566,USA

   分子印迹技术是近期非常活跃的一种分子识别技术，而电色谱是一种高效快速的微分离技术。分子印迹技术与电色谱的结合近期已吸引了一些学者的关注 [1-3]。但分子印迹手性拆分机理的研究，则相对较少[4，5]。而这些基础研究对于指导实际工作，如聚合条件的选择及色谱条件的优化具有重要的意义。
萘普生（naprofen）为属非甾体类消炎镇痛药，近年利用毛细管电泳拆分消旋萘普生的研究已见报道[6]。瑞典的Mosbach小组[7]和日本的Haginaka小组[8-10]也先后以S-体的萘普生为模板分子合成了印迹聚合物，并利用HPLC的方法对其外消旋体进行了拆分，但尚为见对S-萘普生印迹聚合物的手性拆分机理的研究。有鉴于此，本文选择了S-萘普生为为模板制备印迹整体柱，以电色谱模式进行手性拆分，并研究了手性拆分机理。
1.1 仪器和试剂
S-萘普生（S-NAP）和外消旋的萘普生(rac-NAP)购自浙江仙居制药厂，α-甲基丙烯酸(MAA，分析纯，北京化工厂)；二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA, Alfa Aesar 公司），偶氮二异丁腈（AIBN, 天津福晨化学试剂厂，分析纯），γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MPS, Aldrich公司），其余试剂均为分析纯或色谱纯。
Beckman P/ACETM system MDQ 高效毛细管电泳仪（Beckman 公司），配有UV检测器和IBM计算机（安装P/ACE system MDQ 工作站），熔融石英毛细管（100 m i.d., 375 m o.d., 河北永年光导纤维厂）。
1.2 毛细管壁的预处理
先用1 mol/L NaOH溶液冲洗毛细管30 min，再用水冲洗30 min。注入0.4% MPS的6 mmol/L乙酸溶液，室温下反应1.5 h。用水冲净后，氮气吹干。
1.3 印迹聚合物的制备
称取S-萘普生5.75 mg(0.025 mmol)，引发剂AIBN 3.60 mg，依次加入功能单体MAA 9 L(0.1mmol)，交联剂EDMA 76 L(0.4 mmol)，甲苯为732 L，异辛烷183 L，甲苯:异辛烷 = 4:1（v/v）。超声溶解10 min，然后将此溶液用注射器注入40 cm长的毛细管中，两端用橡胶塞密封后，放入53℃的恒温水浴锅中，控制反应长度为20 cm，反应3 h。聚合完成后，用甲醇-乙酸（9:1，v/v）冲洗除去毛细管中未反应的聚合物混合液和印迹分子，再用乙腈洗去残留的乙酸。窗口是在装入卡套前，在距填料2 mm处烧去毛细管外表面的聚酰亚胺涂层而得。
1.4 电色谱实验
实验在Beckman P/ACE system MDQ高效毛细管电泳仪上进行的。流动相为乙腈/NaAc-HAc (pH 3.0, 50 mmol) (80:20, v/v)，样品用乙腈溶解，紫外检测（波长为254 nm）。
2. 结果与讨论：
2.1 电色谱手性拆分机理的研究
手性分离过程中的焓变和熵变可由下式给出[11]：
lnk’ = -ΔH/RT +ΔS/R +lnΦ = -ΔH/RT +ΔS’/R
Φ是相比，R是气体常数，ΔS’为表观熵变
手性分离过程中吉布斯自由能的变化可由Gibbs-Helmhol公式描述[4]：
-ΔΔG = RT ln 
ΔΔG是两种手性对映体与印迹聚合物结合的吉布斯自由能的差异，是手性分离过程中两种手性对映体的分离因子。吉布斯自由能的变化主要由手性分离过程的两种手性对映体的焓变差值和熵变差值所决定[11]：
ln = -（ΔΔH/RT）+（ΔΔS/R）
通过测定不同温度下手性分子的容量因子k′和手性选择因子α，以lnk′和lnα分别对1/T作图，可以得到一条直线，斜率分别为-ΔH/R和-ΔΔH/R，截距为ΔS/R和ΔΔS/R，从而可以求得对映体与手性固定相相互作用的自由焓ΔH及其差值ΔΔH、熵变ΔS及其差值ΔΔS[11,12]。因此，通过考察温度对手性分离的影响，可以计算出手性分离过程中相应的热力学参数，从而对手性分离过程有更加深入的了解。
在电色谱中，由于电泳和色谱保留的双重作用，因此带电荷的物质的迁移速率um可以下式表达[13]：
um = (uep+ueo)/(1+k*) = [ueo(1+kep*)]/(1+k*) （1）
uep 是带电荷的物质的电泳速率，ueo 是流动相流速，k*是电色谱的保留因子，1/(1+k*)是延迟因子（retardation factor），kep*是速率因子。
k*和kep*表示如下：
k* = [tm(1+ kep*)-t0]/t0 （2）
kep* = uep/ueo = (L/tm,CE) / (L/tm,) = tm /tm,CE （3）
tm是带电荷的物质的迁移时间，t0是电色谱中电渗流标记物的迁移时间。tm,CE带电荷的物质CZE模式操作的迁移时间，L是毛细管整体柱的进样端至检测窗口的距离。
k* 及kep*可以在电色谱实验中测定。uep可用与电色谱操作中同样的流动相条件以CZE模式操作获得。
实验数据按上面的公式求出S-萘普生和R-萘普生的保留因子k*S和k*R。以ln k*S和ln k*R分别对温度的倒数作图，见图1和图2。根据ln k*对温度的Van’t Hoff 图（图1和图2），在我们研究的温度范围内（15-55 ºC ）基本呈现一种线性关系。根据线性回归的斜率和截矩，可得ΔHS = -3070. 8 J mol-1，ΔS’S= -1. 04599 JK-1 mol-1，ΔHR = -3381.2 J mol-1，ΔS’S = -1.174 JK-1 mol-1。从ΔH和ΔS的符号可以看出，分子印迹手性固定相的手性分离过程是焓控制过程。由于ΔH和ΔS很少是由某一个单一的过程来决定，事实上，对我们进行手性分离的电色谱过程来说，手性识别应是一个多种效应的综合结果。这些效应包括溶质分子和结合位点的溶剂化和去溶剂化、未溶剂化的溶质分子和结合位点的相互作用、相互缔合的溶质的溶剂化、溶质分子的构象变化、以及多种平衡和混合保留机理。因此，只有通过绘制了ln对1/T的Van’t Hoff

图1 在S-萘普生印迹的整体柱上S-萘普生的容量因子(k*)对温度的Van’t Hoff图
Figure 1 Van’t Hoff plot of the capacity factor (k*) of (S)-naprofen versus temperature on the (S)-naprofen-imprinted monolith.

图2 在（S）-萘普生印迹整体柱上（R）-萘普生的容量因子(k*)对温度的Van’t Hoff图
Figure 2 Van’t Hoff plot of the capacity factor (k*) of (R)-naprofen versus temperature on the (S)-naprofen-imprinted monolith.

图，才可将所有与手性分离过程无关的贡献消除。由于电色谱中的色谱保留和电泳迁移的双重作用，所以精确计算两种手性对映体各自的保留因子非常困难，因此此处用两种手性对映体在整体柱上的保留时间的比值代替分离因子，进行近似计算[4]：
’ = tS/tR
tS，tR分别为S-萘普生和R-萘普生的保留时间
我们根据实验数据绘制了ln’对温度的Van’t Hoff 图（图3），结果显示在实验温度范围内（15-55 ºC ），ln’与1/T基本呈现一种线性关系。根据线性回归的斜率和截矩，我们求得ΔΔH 为

图3 在(S)-萘普生印迹的整体柱上外消旋萘普生的分离因子(’)对温度的Van’t Hoff图
Figure 3 Van’t Hoff plot of separation factor (’) of rac-naprofen versus temperature on the (S)-naprofen -imprinted monolith.

-19.003 J mol-1，ΔΔS 为0.389 J mol-1 K-1。ΔΔH 的绝对值越大，说明在电色谱分离过程中对映体与聚合物结合的强度差异越大，手性分离的选择性越强；ΔΔS 的绝对值越大，说明对映体在与印迹聚合物作用时的有序性增加差异越大。
我们进一步计算了298 K下的ΔΔG298 = -96.916 J mol-1。ΔΔG298 的符号说明，在25ºC 下，电色谱分离在实验条件下是能自发进行的。
参考文献
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Study of mechanism of chiral separation on (S)-naprofen imprinted monolith by capillary electrochromatography
Liu Zhaosheng1 Xu Yanli3 Gao Ruyu2 Yan Cao4
（1College of Pharmacy, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
2Institute of Element Organic Chemistry, Nankai University, Tianjin 300071,China
3Tianjin Key Laboratory of Microbial Functional Genomics, TEDA College, Nankai University, Tianjin 300457, China
4Unimicro Technologies. Inc.,4713 First Street,Pleasanton,CA 94566,USA)