人体胃粘膜活检组织中8-羟基脱氧鸟嘌呤的HPLC测定
何天稀1*，王立光1, 赖容1，娄方1，谢义武1，侯经国2，高锦章2
（1 重庆后勤工程学院，重庆 400016
2 西北师范大学化学化工学院， 兰州 730070）

  摘要：使用C18柱，50mmol/L的磷酸二氢钾（pH =5.5）-10%的甲醇（v/v ）,在HPLC上快速检测了健康人与病人胃粘膜活检组织中的脱氧鸟嘌呤（deoxyguanosine，dG）和8-羟基脱氧鸟嘌呤（8-oxo-7,8-dihydro-2’deoxyguanine，8-OHdG）的含量。方法线性范围分别为0.02~40mg/ml、0.015~10mg/ml，检测限可达到0.01mg/ml 、0.008mg/ml。实验发现病人胃粘膜活检组织中的8-OHdG的含量远远高于健康人。
  关键词：8-羟基脱氧鸟嘌呤,胃粘膜活检组织，疾病诊断

    活性氧自由基在生物体内可以造成大量的DNA的损伤[1]，导致DNA结构和功能变化，发生DNA氧化损伤。在已发现的DNA氧化损伤产物中，8-OHdG为主要氧化损伤产物且化学性质较稳定，因此常用8-OHdG作为反映有机体中DNA氧化损伤的生物标志物[2]。目前，定量分析DNA中的含量常用的方法有32P后标记-薄层层析法（32P-Postlabeling-TLC assay）[3]，气相色谱-质谱-选择性离子测量分析法（GC-MS-SIM）[4]，高效液相色谱-毛细管气相色谱-质谱分析法（HPLC-GC-MS）[5]，高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）[6]。我们采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）快速测定了健康人与病人体胃粘膜活检组织中8-OHdG的含量，并进行了对比。
1 实验部分：
1.1试剂和仪器：
   研究群体胃粘膜活检组织样品及dG，8-OHdG标品由苏海翔博士提供， KH2PO4和CH3OH均为国产分析纯，实验用水为二次蒸馏水。日本岛津LC-6A高效液相色谱仪系统，流动相用KH2PO4与甲醇配制，使用前超声脱气。
1.2研究群体：
   研究群体中包括111名成员，其中健康者为21人，90人为家住癌症高发地区胃病患者。从组织病理学将他们分成五组，正常对照的健康人21人，慢性非萎缩性胃炎38人，慢性萎缩性胃炎17人，高分化胃腺癌15人，以及低分化胃腺癌20人。     
1.3样品处理及分析程序：
   400mg/mL的dG与10mg/mL 8-OHdG用二次水稀释成不同的一系列浓度用来做工作曲线，人体胃粘膜活检组织样品按照等Kendall [7]人的方法稍作变动。样品处理过程采用无氧处置水解样品。人体胃粘膜活检组织样品水解前放置于-80°C环境中，水解时首先将人体胃粘膜活检样品在冰浴中匀浆，然后加入链霉蛋白酶和乙醇，将DNA中8-羟基脱氧鸟苷水解下来，然后用0.22mm Millipore微滤膜除去酶及其它大分子，直接进样。人体胃粘膜活检组织中8-OHdG含量通过0.04~10mg/ml的标准溶液的线性曲线来分析。使用0.08~40mg/ml的标准溶液作用dG的线性回归曲线。8-OHdG的含量用8-OHdG/105dG来表示。
使用反相色谱法在Waters C18柱上进行8-OHdG的分离与测定，流动相包括50mmol/mL KH2PO4（pH=5.5）和10%的甲醇（v/v）。流速为1ml/min，每次进样量20ml，分析温度20°C，检测波长260nm。
2.结果与讨论：
    图1是标品溶液、健康人和高分化胃腺癌患者体内胃粘膜活检组织中8-OHdG与dG的色谱图。如图所示，8-OHdG与dG的保留时间分别在8min与12 min左右；回归方程分别为Y=10852.4+40036.4X, Y=1605.8+6613.3X, 相关系数分别为0.9972、0.9923； 线性范围分别为0.02~40mg/ml，0.015~10mg/ml；信噪比为3时8-OHdG的检测限为0.008mg/ml，dG的检测限为0.01mg/ml，回收率为90.5±3.1%。同一样品进样五次保留时间的相对标准偏差为1.25%，峰面积相对标准偏差为1.81%。不同的研究对象胃粘膜活检组织中的8-OHdG/105dG的测定结果如表1所示。从试验中得知，个体之间的8-OHdG的含量差别较大，所有病人胃粘膜活检组织中8-OHdG的含量远远高于健康人体内8-OHdG的含量。
   实验证明，使用HPLC-UV能同时快速、准确的测定多种生物样品且受环境影响很小，可以作为检测DNA氧化产物的一种有效工具。分析结果表明病人胃粘膜活检组织中的8-OHdG含量远远高于健康人的。这种方法用于测定患者体中的8-OHdG含量对疾病的早期诊断与防治具有重要意义,特别是有助于评估一个人患癌症的机率或诊断与氧基有关的疾病。

      
(a)               (b)                    (c)
图1 （a）标品,（b）健康人和（c）高分化胃腺癌病人样品的色谱图
Fig.1 Chromatograms of (a) standard ，(b) Healthy subject and（c）Well differentiated gastric adenocarcinoma sample at pH=5.5 in 50 mmol/L KH2PO4 containing 10% methanol.
表1 健康人和病人的8-OHdG测定结果

Table-1 The results of determination of the health and the patients

参考文献
1.Kasai, H.; Nishimura, S.  Environ. Health Perspect. 1986, 67:111-116
2.Ames,B.N.   Mutat Res. 1989, 214(1):41-46
3. Devanaboyina, W.;Gupta, R.C.; Carcinogenesis, 1996,17(5):917-924
4. Gajewski, E.; Rao, G.; Nackeerdien, Z.  J. Biochemistry, 1990, 29(34):7876-7882
5. Douki, T.; Delatour, T.; Bianchini, F.  Carcinogenesis, 1996, 17(2):347-353
6. Adachi, S.; Zeisig, M.; Moller, L.  Carcinogenesis, 1995, 16(2):253-258
7. T. L. Kendall, D. J. Byerley, R. Dean,  Anal.Biochem. 195 (1991) 74-76

Determination of levels of 8-hydroxydeoxyguanosion in health and patients gastric mucosal biopsy by HPLC-UV

He Tianxi1*, Wang Liguang1, Lai Rong1, Lou Fang1, Xie Yiwu1, Hou Jingguo2, Gao Jinzhang2
（1Department of oil Application and management , Logistic Engineering of University, Chongqing  400016

2 College of Chemistry and Chemical Engineering , Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China）

Abstract A method is described for the determination of levels of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) in healths and patients gastric mucosal biopsy using high-performance liquid chromatographic (HPLC) system. 8-OHdG and 2-deoxyguanosine (dG) are simultaneously on determined C18 column using potassium phosphate buffer (50mM pH 5.5)—methanol (90/10 v/v) as eluent. The linear range of 8-OHdG is 0.015~10mg/ml and limits of detection is 0.008mg/ml. The mean level of 8-OHdG is much higher in patients than in health human. These data provide an important basis for some illness diagnosis.
Keywords: 8-oxo-7,8-dihydro-2’deoxyguanine; gastric mucosal biopsy; illness diagnosis

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作者简介：何天稀（1976年生），男，讲师，主要从事分离科学与油料检测技术。