双波长反相高效液相色谱法测定人血清中维生素A、E的含量
许蕴 马经野 深圳市第二人民医院中心实验室，深圳（518035）

[摘要] 目的：建立双波长反相高效液相色谱同时测定人血清中维生素A、E浓度的方法， 方法：移取血清，加入乙腈乙醇混合溶液及正己烷，旋涡混合、离心，分离正己烷层氮气吹干，残渣用流动相溶解后进样。流动相为甲醇∶水（92∶8）；流速1mL/min；柱温30℃，紫外检测器在325nm和292nm检测VA和VE。 结果：VA保留时间为2.63min，浓度线性范围50 ~800μg?L－1，R2=0.9995，平均回收率为97.3%，（RSD＜5%），最低检出量0.4ng(S/N>3)；VE保留时间为7.61min，浓度线性范围2 ~16 mg?L－1，R2=0.9999，平均回收率为96.2%，（RSD＜6%），最低检出量2ng (S/N>3)。40例健康成人血清VA平均值为(389.0 ±138.0)μg?L－1 ，VE平均值为(10.20 ±2.51 )mg?L－1 。结论：双波长RP-HPLC检测血清中VA和VE浓度的方法灵敏度高，回收率和重现性良好，操作快速、简便。
[关键词] 维生素A，维生素E，血清，HPLC

Determination of vitamin A & E in human serum by RP-HPLC

Xu Yun, Ma Jingye, Fu Lin, Shi Dunyun, Qian Wenjing, Ni Xiaoyi, Wang Xiaoli, Zeng Lijuan The Central Laboratory of Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035

Abstract Objective:To establish a HPLC assay for the determination of vitamin A（VA） and vitamin E（VE） in human serum and evaluate the nutritional value of the body’s of VA and VE. Method: The serum was extracted with n-hexane after the protein in the serum was deposited with acetonitrile /alcohol. The layer of n-hexane was dried with nitrogen, and the leavings dissolved with mobile phase and determined by HPLC. VA and VE were separated on XTerraTM RP18 5μm，3.9mm×150mm column, at 292nm for VE and 325nm for VA with UV detector. Using methanol / water(92 / 8) as mobile phase when the column temperature is at 30℃. Results: The linearity range of calibration curve of VA is 50 ~800μg?L－1 (R2=0.9995). The average extracted recovery is 97.3%, RSD＜5%. The linearity range of calibration curve of VE is 2 ~16 mg?L－1 (R2=0.9999). The average extracted recovery is 96.2%, RSD＜6%. The detection limit of VA is 0.4ng and VE is 2ng (S/N>3). The whole operation can be finished in less than 30 minutes. Conclusion: The method is sensitive, rapid, accurate and simple.
Keywords: Vitamin A, Vitamin E, serum, HPLC

　　维生素A(Vitamin A, VA)和维生素E(Vitamin E, VE)是脂溶性维生素，具有重要的生理药理作用。建立血清VA和VE的检测方法在临床应用上有实际意义。本研究在文献[1~4]基础上，优化了样品前处理方法及色谱条件，建立了双波长反相高效液相色谱同时测定人血清中VA和VE浓度的方法，提高了灵敏度，且操作简单、快速，结果重现性好，具体方法报告如下。

[作者简介] 许蕴 女，大学，高级工程师（0755）83792752
1 仪器与试药
1.1仪器 Waters alliance 2695型高效液相色谱仪，Waters 2487型紫外检测器， BESEP氮吹板，低速大容量离心机，旋涡振荡器。
1.2试药 甲醇、乙腈为色谱纯；其它试剂为分析纯；双蒸水经微孔滤膜滤过后使用；高纯氮气；维生素A（all-trans-retinol）Sigma公司产品，色谱纯，批号为034K5004；维生素E（α-Tocopherol）Aldrich公司产品，色谱纯，批号为S20796-254。

2 方法与结果
2.1方法
2.1.1色谱条件 XTerraTM RP18色谱柱（3.9 mm×150mm，5μm）， XTerraTM RP18 预柱（3.9 mm×20mm，5μm），柱温30℃；流动相为甲醇∶水（92∶8）；流速1mL/min；在292 nm 和325nm同时进行双波长检测；进样量：20μL。
2.1.2标准溶液的配制 精确称取VA和VE标准品，用甲醇配成浓度为 1g?L－1 的储备液，于－20℃冰箱保存。测定前移取储备液用甲醇稀释成工作液，VA浓度为10 mg?L－1 、维生素E浓度为100 mg?L－1 。移取工作液用流动相配制成标准应用液，VA浓度为50，100，200，400，800μg?L－1，VE浓度为1，2，4，8，16 mg?L－1
2.1.3血清VA、VE浓度的测定方法 取血清200μL置试管中，加入乙腈∶无水乙醇(50∶50)混合溶液400μL，旋涡混合1min，再加入10%二氯甲烷的正己烷溶液400μL，旋涡混合1min，以3000r?min－1离心3min，移取正己烷层置于离心管中，氮气吹干，残渣用200μL流动相溶解，按照2.1.1的色谱条件一次进样，选择292 nm 和325nm两个波长同时进行检测，VA和VE与血清内源性杂质分离良好，杂质不干扰分析。上述操作可在30min内完成。
2.1.4标准曲线的制备 取VA和VE标准应用液，按照2.1.1的色谱条件做HPLC测定，以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归。
2.2结果
2.2.1色谱行为 上述色谱条件下，在325nm检测VA，在292nm检测VE，VA和VE的标准品溶液及血清样品的色谱图如图1所示，VA和VE的保留时间分别为2.63min和7.61min，与血清内源性杂质分离良好，不影响测定。

2.2.2线性关系与灵敏度VA回归方程为y=19.5x－311.66，R2=0.9992，在50~800μg?L－1范围内线性良好；VE回归方程为y=7396.4x＋110.46，R2=0.9999，在1~16 mg?L－1范围内线性良好。以信噪比大于3的浓度作为检出限，进样量为20μL， VA最低浓度为20μg?L－1，故最低检出量为0.4ng；VE最低浓度为100μg?L－1，故最低检出量为2ng。
2.2.3方法回收率 取混合血清，分别加入 VA、VE标准工作液，配制高、中、低三种不同浓度的样品，含VA标准品浓度为50、200、800μg?L－1，含VE标准品浓度为1、4、16 mg?L－1，每种浓度的血清配制6份，按照 2.1.3所述方法操作，测定加标血清的浓度CAX、CEX及空白血清的浓度CA0、、CE0，提取回收率=(Cx－C0 )/ Cs ×100%（Cs为所加入标准品的浓度），回收率试验结果见表1，VA平均回收率为97.3%，RSD＜5%；VE平均回收率为96.2%，RSD＜6%。

2.2.4精密度 取混合血清，分别加入 VA、VE标准工作液，配制高、中、低3种不同浓度的血清样品，含VA标准品的浓度为50、200、800μg?L－1，含VE标准品的浓度为1、4、16 mg?L－1，每种浓度血清配制5份,测定日内差，每天配高、中、低三种不同浓度的血清样品，连续作5天，测定日间差。VA 3种浓度血清的日内RSD分别为5.27%，6.11%，4.89%（n=5），日间RSD分别为6.29%，5.77%，7.95%（n=5）；VE 3种浓度血清的日内RSD分别为4.27%，5.38%，6.59%（n=5），日间RSD分别为4.88%，6.06%，5.73%（n=5）。
2.2.5 稳定性试验 分别取含有高、中、低3种浓度标准品的血清，各6份。按2.1.3所述方法，其中1份立即处理、测定；3份于室温下分别放置1h，2h，4h后处理、测定；另外2份置于－20℃冰箱中密封保存，分别于冻藏2周及3月时取出样品解冻，然后处理、测定。结果血清样品中VA及VE浓度的变化均小于5％，说明血清样品在－20℃保存3月稳定。
2.2.6 40例成人血清VA和VE含量的检测结果 用本文方法测定了40例健康成人血清的VA和VE含量，结果见图2，血清VA平均值为（389.0 ±138.0）μg?L－1，血清VE平均值为（10.20±2.51）mg?L－1，与文献报道值相近。

3 讨论
　　应用液相色谱同时分析VA和VE的浓度，有单波长检测和双波长检测两种方法，其中采用单波长检测方法的文献报道较多，通常选择VA吸收较强的波长检测，但是由于VA和VE吸收特性的差异， VA的最低检出量需1ng以上，VE的最低检出量则要50～100ng，灵敏度很低。文献报道的双波长检测采用萃取液直接进样，萃取剂可能对VA的测定产生干扰，VA的最低检出量也需0.8ng， VE的最低检出量则要10ng以上。
　　本文采用氮气吹干萃取液，流动相溶解残渣的方法，同时优化色谱条件，在所有组分良好分离的情况下，缩短了检测时间，10分钟可完成一个样品的色谱图。用目标分析物的标准品作外标，以 VA和VE特征吸收波长检测，避免了血清内源性杂质对目标分析物的干扰，大大提高了灵敏度，不仅满足了生理条件下人血清VA、VE浓度的检测，同时为病理条件VA和VE血液浓度的检测或更低含量VA和VE的研究提供了方法。
　　VA和VE在空气中易被氧化，采血后应尽快将血样离心分离，密封冻存于－20℃冰箱中备检。在此条件下储存的血清样品，3个月内稳定，结果重现性良好。因此本文建立的双波长RP-HPLC检测人血清中VA和VE浓度的方法操作简单、快速、准确，成本低，适宜作为常规临检项目开展，检测结果可以作为人体维生素A、E营养状况的评价指标。

参考文献
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[4] 尹江伟 刘红河 邹晓春等，反相高效液相色谱法同时测定儿童血清中维生素A和E. [J] 现代预防医学2004， 32（3）：351-352