用双酶电化学生物传感器检测对硫磷的研究
康天放 闫骏 高慧丽
北京工业大学环境与能源工程学院， 北京， 100022

　　近年来，食品安全已成为人们关注的热点问题，开发用于蔬菜、水果等样品中农药残留的快速检测技术对防止受农药污染的农产品进入销售市场有着重要意义. 本文以对硫磷作为有机磷农药的模型分子，研究了利用固定化胆碱氧化酶（ChO）和乙酰胆碱酯酶（AChE）的电化学生物传感器检测有机磷农药残留的方法，取得了满意结果.
1 实验部分
　　ChO和AChE购自Sigma公司，2-吡啶醛肟甲基碘化物（2-PAM）购自Aldrich公司，氯化乙酰胆碱购自北京化学试剂公司，对硫磷由农业部农药检定所提供，其它所用试剂均为分析纯，Pall膜（孔径：0.45μm，厚度：150μm）购自Pall公司，溶液用二次蒸馏水配制. 所有电化学实验均在CHI 660A电化学分析仪（上海辰华仪器公司）上完成，实验采用三电极系统，以固定了ChO和AChE的铂盘电极（直径4 mm）为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）和铂片电极分别作参比电极和对电极.
　　准确吸取20μL浓度为10 U/mL的ChO溶液和2μL浓度为1%的牛血清白蛋白（BSA）溶液，混匀后滴加到铂盘电极表面，滴加2μL浓度为5%的戊二醛溶液，室温下风干，制得ChO电极. 用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液配制浓度为25 U/mL的AChE溶液，吸取60μL该溶液与6μL浓度为1%的BSA充分混匀后，吸取该混合溶液22μL于直径为6 mm的Pall膜上，风干后，置于自制的架子上，用12.5%的戊二醛室温下熏蒸3 h，然后将Pall膜酶面朝外，用O型圈固定在ChO电极上. 此双酶电极含有0.2 U的ChO和0.5 U的AChE，置于4℃保存备用. 每次实验完成后，将该酶电极置于1%的2-PAM溶液中，对酶电极上受到有机磷农药抑制的AChE活化10 min，每片固定了AChE的Pall膜可以重复使用10～15次.
2 结果与讨论
　　在AChE的催化作用下，氯化乙酰胆碱水解为氯化胆碱和乙酸，在ChO的催化作用下，氯化胆碱与溶解氧反应生成甜菜碱和H2O2. 相应的反应式如下：
　　

　　利用H2O2在基础电极上的的氧化电流的大小，可以间接测定有机磷农药的含量，农药的含量越高，对AChE的抑制作用就越强，所生成的氯化胆碱的浓度就越低，生成的H2O2浓度也就越低，因此，H2O2的氧化电流信号就越小. 在恒电位条件下，记录静止溶液中H2O2的氧化稳态电流iss1，然后加入含有机磷农药的溶液，记录衰减后的稳态电流iss2，按以下公式计算百分抑制率(I%)[1]：
I% = [ (iss1 － iss2)/iss1] × 100%
　　将所制备的ChO电极置于0.1 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，于+ 0.4 V进行安培法实验，测定ChO/Pt电极在一系列不同浓度的胆碱溶液中的稳态电流. 考察了ChO的用量对ChO电极响应性能的影响. 当ChO的用量为0.2 U时，响应最灵敏，故确定ChO的最佳用量为0.2 U. 由于戊二醛蒸汽容易均匀地扩散到酶膜表面，所以熏蒸法对于大批量生产生物传感器是一种简便而易于控制的固定酶的方法，近年来受到人们的重视[2]. 本文采用熏蒸法固定AChE，使密闭容器中的戊二醛蒸汽在室温下挥发到载有AChE和BSA的Pall膜表面，通过低浓度的戊二醛蒸汽与AChE发生较为缓和的交联反应，以便固定AChE，每次至少可以同时熏蒸3张膜. 通过一系列条件实验，本文选定制备生物传感器的AChE最佳用量为0.5 U， 室温下熏蒸持续时间以3 h为宜. 将所制备的AChE/ChO/Pt电极置于0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，用安培法进行实验，工作电位采用+ 0.4 V，实验结果表明，响应电流与乙酰胆碱浓度之间在 5.0×10－6 mol/L ~ 1.2×10－3 mol/L浓度范围存在线性关系，在信噪比为3:1的条件下，乙酰胆碱的检测限为1.1×10-6 mol/L.
3 应用
　　当酶电极浸入含有2.0×10-4 mol/L氯化乙酰胆碱和5%丙酮的0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中时,以 + 0.4 V为工作电位，用安培法测定乙酰胆碱的响应电流. 加入一定量的对硫磷标准溶液，随抑制时间的延长，响应电流逐渐减小.实验结果表明对硫磷对AChE活性的抑制达到稳定需要10 min. 测定了一系列不同浓度对硫磷标准溶液的响应电流，根据响应电流计算出的百分抑制率与对硫磷浓度的对数值在1.0×10－8 g/L ～1.0×10－4g/L范围呈线性关系，当抑制率为10%时相应的农药的浓度可被定义为生物传感器对农药的检测限[3]，按照10%的抑制率（I10%）计算，对硫磷的检测限为2.4×10－9 g/L.

　　称取新鲜小油菜叶5.0 g，破碎成1 cm2的碎片后，置于洁净干燥的浅口玻璃瓶中，取0.10 g/L的对硫磷溶液50μL，喷撒于菜叶样品上，盖上瓶塞，放置过夜. 用含5%丙酮的0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐洗脱液将该样品中的对硫磷洗脱、定容，得到对硫磷样品溶液. 用所拟定的方法测定稳态电流，根据稳态电流值计算I%，并根据工作曲线求得对硫磷浓度. 在同样条件下平行测定4份样品，加标回收率实验结果如表1所示. 样品的加标回收率在87～105%之间，说明该传感器用于实际样品的检测具有比较好的效果.
　　本课题得到国家自然科学基金(No.20247002) 和北京市教育委员会科技发展计划项目基金(Km200310005008)的资助，特此致谢！
参考文献
[1] Zhang S, Zhao H, John R, A Theoretical model for immobilized enzyme inhibition biosensors [J], Electroanalysis, 2001, 13 (18): 1528~1534.
[2] Li Y G, Zhou Y X, Feng J L, Jiang Zh H, Ma L R, Immobilization of enzyme on screen-printed electrode by exposure to glutaraldehyde vapour for the construction of amperometric acetylcholinesterase electrodes [J], Analytica Chimica Acta, 1999, 382 (3): 277~282.
[3] Lee H S, Kim Y A, Cho Y A, et al. Oxidation of organophosphorus pesticides for the sensitive detection by a cholinesterase-based biosensor [J]. Chemosphere, 2002, 46(4): 571~576.