HPLC法对过亚硝酸根抑制剂筛选的研究
刘立亚 罗云敬* 李荣新 钟儒刚
（北京工业大学生命科学与生物工程学院 北京 100022）

摘要：过亚硝酸根（peroxynitrite, ONOO-）是由体内一氧化氮和超氧根阴离子反应生成的一种细胞毒性物质，能和许多生物大分子反应，如DNA、蛋白质和脂质等。本文通过高效液相色谱方法来研究槲皮素和黄酮对ONOO-诱导的DNA碱基修饰以及酪氨酸硝化的抑制作用，结果表明槲皮素抑制效果显著，黄酮几乎没有效果。本实验的意义还在于可以将本方法推广到其他过亚硝酸根抑制剂的筛选实验中，成为一种比较有效且灵敏的抑制剂评价方法。
关键词：过亚硝酸根 8-羟基脱氧鸟苷 3-硝基酪氨酸 黄酮类化合物
　　过亚硝酸根是人体内产生的一种细胞毒性物质，具有强氧化性，依据不同的机理（如形成羟自由基或活性中间体等）与生物大分子作用，如蛋白质和DNA等。DNA的四种碱基都可被过亚硝酸根修饰，但鸟嘌呤最易被修饰[1-2]，其主要产物是8-硝基鸟嘌呤[2] 和8-羟基脱氧鸟苷[3]。其中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是一种反映DNA氧化损伤程度既灵敏又稳定的指标，又是一种与肿瘤的发生发展相关的生物标记物。过亚硝酸根与酪氨酸反应的主要产物是3-硝基酪氨酸(3-NT)[4]，而3-硝基酪氨酸在许多病理环境中都被检测到，是蛋白质受损的指标。
　　黄酮类化合物已被确认为有效的自由基天然清除剂之一。虽然黄酮类化合物清除自由基和ONOOH的体外实验报道不少，但在液相色谱条件下同时以8-羟基脱氧鸟苷和3-硝基酪氨酸的生成量为指标，对黄酮类化合物抑制损伤能力进行比较的研究还少见报道。本文希望通过上述实验方法，建立一种评价抑制剂对过亚硝酸根损伤抑制能力的方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
　　高效液相色谱-电化学检测器(荷兰ANTEC Leyden)、高效液相色谱-紫外检测器（515 HPLC Pump购自Waters公司，SPD-10A紫外检测器购自岛津公司）；脱氧鸟苷（纯度为99-100%）、8-羟基脱氧鸟苷（纯度为99-100%）、酪氨酸（纯度为99-100%）、槲皮素（纯度为99%）、黄酮（纯度为99%）以上试剂均购于Sigma?-Aldrich公司
1.2 过亚硝酸根的制备
　　过亚硝酸盐溶液按Rao M.Uppu 与 William A.Pryor的方法制备[5]。采用紫外分光光度计测定过亚硝酸根的浓度(ε=1670mol-1cm-1)。使用前用0.1mol/L的氢氧化钠稀释。
1.3槲皮素等对过亚硝酸根诱导的8-OHdG生成的影响
　　将10μL 0.2mol/L的过亚硝酸根溶液加入到含50μL 10mmol/L脱氧鸟苷、不同浓度抑制剂溶液的Tris-HCl缓冲溶液中，最终体积为1mL，pH为7.4。将反应混合物放在20℃水浴中15分钟，用HPLC-ECD测定8-OHdG。色谱条件：色谱柱选用德国KNAUER反相C18柱，其规格是4.6mm×250mm，粒径为5μm。流动相配比为醋酸纳缓冲液：甲醇：水=100：

基金项目：北京市科技新星基金资助（项目编号：2003B05）；教育部留学回国人员科研启动基金资助（基金编号：00099）；北京市自然科学基金资助（项目标号：2052004）
刘立亚（1980-），男，北京工业大学生命科学与生物工程学院硕士研究生；*联系人：luoyj@bjut.edu.cn

150：750，醋酸纳缓冲溶液中含125mmol/L的柠檬酸、250mmol/L的醋酸钠、0.57mmol/L的醋酸、25μmol/L EDTA。工作温度为35℃，流速选用1mL/min，工作电压为600毫伏。
1.4槲皮素等对过亚硝酸根诱导的3-NT生成的影响
　　将10μL 10 mmol/L的过亚硝酸根溶液加入到含0.1mol/L的酪氨酸、不同浓度抑制剂溶液的磷酸盐缓冲溶液中，最终体积为1mL，pH为7.4。将反应混合物放在20℃水浴中15分
钟，用HPLC-UV测定3-NT。色谱条件：色谱柱选用德国KNAUER反相C18柱，其规格是4.6mm×250mm，粒径为5μm。流动相为甲醇：　　40μmol/L磷酸溶液=100：900。流速选用1mL/min。
2 结果与讨论
2.1 过亚硝酸根诱导产生8-OHdG和3-NT的色谱图


图1中A为过亚硝酸根对DNA氧化修饰产生8-OHdG的色谱图，B为过亚硝酸根对酪氨酸硝化修饰产生3-NT的色谱图。从图中可以看出，8-OHdG和3-NT都很好地与其他峰分离开，可以对这两种损伤产物进行定性定量检测。而且HPLC-UV检测8-OHdG以及HPLC-ECD检测3-NT的灵敏度也非常好，8-OHdG的最小检测浓度可达pmol/L，3-NT的最小检测浓度也可达μmol/L。因此这两种损伤指标可以应用到过亚硝酸根损伤生物大分子及其抑制剂的研究工作中。×
2.2 槲皮素等对过亚硝酸根诱导的8-OHdG和3-NT生成的影响



从图2中，可以明显看出对由过亚硝酸根造成的DNA碱基修饰及酪氨酸修饰，槲皮素的抑制效果显著，而黄酮的抑制效果几乎没有。这可能是由于槲皮素B环上存在酚羟基，可以与过亚硝酸根产生的自由基反应生成苯氧自由基，而苯氧自由基比较稳定，从而终止了自由基链式反应，达到抑制过亚硝酸根损伤生物大分子的目的；而黄酮却不存在酚羟基，因此起不到清除自由基的作用。
从上述试验结果来看，通过高效液相色谱法以8-OHdG和3-NT的生成量为指标来评价抑制剂对过亚硝酸根诱导的生物大分子损伤抑制能力大小，是一种有效且灵敏的方法，因此可以将此方法推广到其他的过亚硝酸根抑制剂筛选试验当中。
3 参考文献
1. Samar B., Jacquin C.Niles.Peter C.Dedon, Steven R.Tannenbarm. Chem.Res.Toxicol.,1999, 12:513-520
2. Yermilov V., Rubio J., Ohshima H. FEBS Lett.,1995, 376:207-210
3. Inoue S., Kawanishi S. FEBS Lett., 1995, 371:86-88
4. Ischiropoulos H., Zhu L., Chen J., Tsai J-H.M., Martin J.C., Smith C.D., Beckman J.S. Arch. Biochem. Biophys, 1992, 298:431-437
5. Rao M.Uppu, William A.Pryor. Anal. Biochem, 1996, 236:242-249

HPLC for Inhibition of Quercetin and Flavone on Biomacromolecules Damage Induced by Peroxynitrite
Liu Liya Luo Yunjng Li Rongxin Zhongrugang
(College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing, 100022)

Abstract: Peroxynitrite is a reactive oxidant produced by nitric oxide and superoxide, which react with a variety of biomacromolecules including proteins, lipids and DNA. We study the inhibitory effects of quercetin and flavone on DNA base modification and tyrosine modification induced by peroxynitrite through the HPLC, the results suggest that inhibition of quercetin is better, but flavone almost has no effect. We believe that the method in this experiment is a available,reliable and sensitive way that can be used in judging other inhibitors of peroxynitrite.
Keyword: peroxynitrite 8-hydroxydeoxyguanosine 3-nitrotyrosine flavonoids