N-乙酰氨基葡萄糖水溶液变旋过程的液质联用和旋光研究

李晓东1，仲宣惟2，张雅军1，尹利辉1（1.中国药品生物制品检定所 北京 100050；2.国家食品药品监督管理局 北京 100810）

摘要：目的 研究N-乙酰氨基葡萄糖在水溶液中的变旋行为。方法 通过液质联用及比旋度分析，监测N-乙酰氨基葡萄糖水溶液的变旋情况。结果 得到基于APCI离子源的N-乙酰氨基葡萄糖的多级质谱图，确认其水溶液变旋稳定时间及稳定状态下的差向异构体组成比例，并对N-乙酰氨基葡萄糖HPLC图中的差向异构体色谱峰进行指认。结论 为存在变旋行为的糖及糖苷类化合物的研究提供了准确可行的方法。
关键词: N-乙酰氨基葡萄糖；变旋；液质联用；比旋度

The Study of Mutarotation of N-Acetylglucosamine in Water by
HPLC/MS/MS and Specific Rotation

LI Xiao-dong1, ZHONG Xuan-wei2, ZHANG Ya-jun1, YIN Lin-hui1（1. National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, China; 2. State Food and Drug Administration, Beijing 100810, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To study the Mutarotation of N-Acetylglucosamine in water. METHODS Combined HPLC/MS/MS with specific rotation to inspect the mutarotation of N-Acetylglucosamine in water. RESULTS The MS/MS and MS3 spectrum of N-Acetylglucosamine was performed by APCI probe. The anomers, final equilibrium time and ratio were confirmed by HPLC/MS/MS and specific rotation. CONCLUSION This study provided available and reliable method for the mutarotation of glucide.
KEY WORDS: N-Acetylglucosamine; Mutarotation; HPLC/MS/MS; Specific Rotation

　　N-乙酰氨基葡萄糖是生物体细胞中糖链的重要组成单元，它可通过?-1, 4糖苷键连接形成均一天然的氨基多糖结构甲壳素（chitin），再经脱乙酰基后形成壳聚糖（chitosan）。研究发现甲壳素、壳聚糖及其衍生物存在多种生物活性，是良好的生物医学材料，在食品、医药、环保等多个领域具有广阔的应用前景[1]。作为构成甲壳素的基本单元，N-乙酰氨基葡萄糖的水溶液存在十分显著的变旋现象(mutarotation) [2-4]，对于水溶液平衡状态下?、?差向异构N-乙酰氨基葡萄糖的比例，文献一般采用旋光计算的方法[5-6]。本文选择来源不同的N-乙酰氨基葡萄糖，使用液质联用与旋光测定相结合的方法，考察了N-乙酰氨基葡萄糖水溶液的变旋平衡过程，为存在变旋现象的单糖及糖苷类化合物的构型及组成分析提供了准确可行方法。

1 仪器与试剂
　　Finnigan LCQ Deca XP Plus液相色谱－质谱联用仪； Surveyor高效液相色谱仪（包括LC泵，自动进样器及PDA检测器）；JASCO P-1020全自动旋光仪，钠灯，检测波长589nm，检测温度20℃；水为三次重蒸水，甲醇为Fisher HPLC级试剂；N-乙酰氨基葡萄糖为山东东营开发区海洋生物化工有限公司出品（HPLC法测定纯度为99.5％），国外对照品为Sigma试剂，纯度99.0％。
2 实验方法
2.1 液质联用条件 Alltech Spherisorb C18液相色谱柱（250?4.6mm，5?m），水/甲醇为流动相（体积比为99/1），流速0.6mL/min， 紫外检测波长200nm，柱温20℃，进样量20?L。质谱采用APCI离子源，正离子检测模式，放电电流10?A，毛细管电压15V，毛细管温度250℃，气化温度450℃，鞘气流速60 arb。
2.2 旋光检测 称取N-乙酰氨基葡萄糖26.57mg（Sigma）及26.47mg（国产）于10mL容量瓶中，用水溶解定容，使用1cm旋光池，立即进行旋光值测定，计算比旋度。
3 结果与讨论
3.1 N-乙酰氨基葡萄糖水溶液的液质联用分析
　　由于糖分子极性较大，在紫外区无吸收，采用低波长检测紫外吸收容易受到干扰，因此对于糖的检测一般采用示差折光检测器和蒸发光检测器。对于小分子糖的分析方法多采用氨基色谱柱及离子交换色谱柱。采用反相色谱柱分析一般来说保留比较困难，本文选取Spherisorb C18液相色谱柱，得到了N-乙酰氨基葡萄糖?、?差向异构体的色谱峰，其结构可通过液质联用得到确认，见图1a，其中N-乙酰氨基葡萄糖?、?异构体的HPLC色谱峰分离度达到1.4，通过峰面积的变化可监测N-乙酰氨基葡萄糖在水溶液中的变旋过程，并给出适时?、?异构体的相对比例。由于小分子糖类的极性较大，故采用APCI离子源即可有效地实现离子化。图1(a)中显示N-乙酰氨基葡萄糖?、?异构体具有完全相同的一级质谱。对于保留时间为t=4.26min，4.59min的色谱峰，相应一级质谱中主要产生m/z204.3、221.9质谱峰，其中m/z221.9为分子离子峰（M+1），m/z204.3为分子脱水峰。图1(b)为N-乙酰氨基葡萄糖?、?异构体的二级质量色谱图，?、?异构体m/z204.3、221.9质谱峰的二级质谱完全一致，m/z204.3在碰撞能量为22%的情况下，主要产生m/z125.9，138.0，167.8，185.8，204.0二级质谱峰；m/z222.1在碰撞能量为32%的情况下，主要产生m/z125.9，167.8，185.8，203.8，222.3二级质谱峰。

　　利用N-乙酰氨基葡萄糖?、?异构体的HPLC-UV色谱峰面积，可判断其组成相对比例。在N-乙酰氨基葡萄糖水溶液配置后进行HPLC-UV分析，保留t=4.59min的色谱峰面积逐渐变小， t=4.26min的色谱峰面积逐渐变大，在一定时间后相对比例达到恒定，说明固相N-乙酰氨基葡萄糖主要由t=4.59min对于的异构体组成。国产及进口N-乙酰氨基葡萄糖具有相同的变化趋势，说明它们固态的构型相一致。
3.2 N-乙酰氨基葡萄糖水溶液的变旋过程
　　制备N-乙酰氨基葡萄糖水溶液，立即进行液质联用分析及旋光测量，间隔一定的时间重复上述实验，循环进行直至旋光值及液相色谱中?、?型异构体的色谱峰峰面积比值达到稳定，见图2(a)和2(b)。从图2的数据中可知，N-乙酰氨基葡萄糖水溶液的在4小时内变旋现象趋于平衡。同文献相比较[3-4]，本文使用来源不同的N-乙酰氨基葡萄糖应为?构型，结合图1a，保留时间t=4.59min的色谱峰对应N-乙酰氨基葡萄糖的?型异构体，t=4.26min为?型异构体。

4 结论
　　本文首次采用液质联用同旋光检测相结合的方法，进行了N-乙酰氨基葡萄糖?、?异构体的HPLC/UV/MS/MS分析，确认变旋稳定时间及HPLC平衡比例组成，为相关类型糖及糖苷类化合物的构型及组成分析提供了准确可行的方法。

参考文献
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