2，6-二-O-丙酰基-β-CD键合硅胶固定相的合成及其手性分离特性研究
马宁，罗爱芹，* 杨少宁，丁广辉，宁周云
（北京理工大学 生命科学与技术学院，北京 100081）

摘　要：合成了2,6-二-O-丙酰基-β-环糊精键合硅胶新型手性固定相，用莫氏(Molisch)颜色试验、X 射线光电子能谱、红外光谱等3种表征手段对硅胶、键合硅胶固定相进行了表征。用高效液相色谱测试了该手性固定相的分离性能。结果表明新制备的手性固定相在反相条件下可以用来分离某些手性药物。
关键词：手性固定相；高效液相色谱；2，6-二-O-丙酰基-β-环糊精；键合硅胶
　　目前，在临床上使用的药物中，约有50%的药物为手性药物的外消旋体[1]。手性药物对映体在生物体内的代谢和药理作用存在显著差异[2]。因此，手性药物的拆分和测定越来越引起人们的普遍关注，并迅速发展成为现代药学研究的重要领域。
　　高效液相色谱技术是20世纪70年代后期发展起来的，特别适用于极性强、热稳定性差的手性药物分离[3,4]，其中环糊精（CD）手性固定相因自身“内疏水,外亲水”的略呈锥筒状的空腔结构,使其在手性药物的分离中具有选择性高，应用范围广，是其它手性固定相所不及的[5,6]。
　　本实验室将β-CD的2位、6位羟基进行衍生化，预留3位键合硅胶,合成了(2，6-二-O-丙酰基-β-CD)键合硅胶固定相，并对其色谱性能进行评价，对几种手性药物进行了初步的分离。其合成路线及该手性固定相的结构如图1所示：


1 实验部分
1.1仪器与试剂
Waters高效液相色谱系统（美国Waters公司）：515二元泵；717自动进样器；996二极管阵列检测器；Milliennium32色谱工作站.Altech色谱柱（150×4.6mm）（美国Alltech公司），红外光谱仪(日本Shimadzu公司)。
　　多孔微球硅胶(日本富士硅化工有限公司,5μm,10nm)，h，γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(KH-560)(武大有机硅新材料股份有限公司),β-环糊精(广东省郁南县环糊精
厂),用蒸馏水多次重结晶精制，用前于60℃真空干燥，N，N二甲基甲酰胺（DMF）用前经氯化钙干燥，用于制备手性固定相的其它试剂均为分析纯,用于手性分离的流动相均为色谱纯，用于手性分离的药物均由北京市药品检验所提供，水为二次重蒸去离子水。
1.2手性固定相的制备
1.2.1 2，6-二-O-丙酰基-β-CD的合成[7,8]
　　在250ml三口烧瓶中加入100mL吡啶, 在电磁搅拌下，分批加入11.35g β-CD, 在冰浴的条件下缓慢滴加12.20m丙酰氯,常温下反应6h,旋转蒸发除去溶剂,产物用三氯甲烷溶解,依次通过盐酸溶液，二次蒸馏水洗涤,无水硫酸钠干燥,蒸馏,50℃真空干燥,得14.22g黄色固体。
1.2.2 2，6-二-O-丙酰基-β-CD键合硅胶的合成[9]
　　称取经干燥的丙酰化β-CD4.84g溶解于50mLDMF中,加入0.50g氢化钠,室温下搅拌反应至无气泡产生,过滤,将滤液放入三口瓶中,滴加1.125mL WH-560,充氮气保护, 于90℃反应4h,加5g硅胶,保持温度在120℃反应24h,冷却，G4砂芯漏斗抽滤,产物依次用甲醇,水,丙酮充分洗涤,于90℃真空干燥12h,称重得7.63g白色固体。
1.3色谱柱的填充
　　通过匀浆法将合成好的手性固定相填充于Alltech色谱柱中（150×4.6mm）,均浆液采用环己醇氯仿（1/3，V1/V2）混合液,顶替剂采用无水甲醇[10]。
1.4色谱条件
　　色谱检测波长：多波长扫描（190～400nm）；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；样品用去离子水溶解，用流动相稀释至1mg/mL；流动相:乙腈-水混合溶液,甲醇-磷酸二氢钾缓冲溶液。
2 结果与讨论
2.1 2,6-二-O-丙酰基-β-CD键合硅胶固定相的表征[11]
　　本实验采用莫氏(Molisch)颜色试验、X射线光电子能谱、红外光谱等3种表征手段对硅胶、键合硅胶固定相进行了表征。
2.1.1莫氏（Molish）试验[12]
　　糖可以在浓酸条件下加热失去水, 生成具有呋喃环结构的糖醛衍生物，再与芳香胺类或酚类缩合生成有色物和α-萘酚作用生成紫色缩合物，应用这一反应可以鉴定糖的存在称为Molish实验.
　　在试管中加入2mL键合硅胶的丙酮悬浊液，然后加入2滴莫氏试剂(α-萘酚的无水乙醇溶液)，摇匀，将试管倾斜，沿试管壁慢慢加入浓硫酸1.5mL，硫酸层沉于试管底部与键合硅胶的丙酮悬浊液分成两层，在液面交界处有紫色环出现，证明β-CD衍生物成功键合到硅胶上。

　　X射线光电子能谱法是以污染碳峰的C1s(284.6eV)为定标标准,扣除荷电效应的影响,从而确定样品的真实结合能,从而测定出化合物中(包括污染碳)各元素的原子浓度比.通过硅胶与(2，6-二-O-丙酰基)-β-CD键合硅胶固定相的X射线光电子能谱图对比可看出,各元素的结合能和含量都发生了明显的变化,从而鉴定键合固定相的反应情况.
　　由表1可知，键合上(2,6-二-O-丙酰基)-β-CD的硅胶与硅胶相比:碳元素含量上升,硅元素和氧元素含量降低。其原因是由于硅胶在键合环糊精衍生物后，分子中碳含量高于硅胶,而硅含量和氧含量比硅胶低所致。

2.1.3傅里叶红外谱图
　　傅立叶红外光谱测试结果表明，合成的手性固定相在3050cm-1处有一个强吸收峰，这是由于丙酰基中不饱和C-H原子的伸缩振动引起的，这说明β-CD的衍生物已经成功地键合在硅胶上面[13][14]。

2.2手性化合物的分离
　　在反相色谱条件下，β-CD类手性柱对手性化合物有较好的分离效果，这是由于手性柱对被测物的保留行为和立体选择性主要与被测物的结构和流动相中的各种成份之间的相互竞争作用有关。水-有机流动相(由Ｈ2Ｏ和含有一定量的有机改性剂如甲醇、乙腈等物质的缓冲溶液组成)能够使被测物的憎水部分与ＣＤ空腔中相对非极性部分之间形成包络物，从而达到手性分离结果[15]。
表2 尼莫地平、盐酸克伦特罗在2，6-二-O-丙酰基-β-CD键合相上分离数据
Tab.2　Date of Nimodipine and Clenbuterol Hydrochloride separated by the Heptakis (2,6-di-O-Propionyl)-β-Cyclodextrin stationary phase
手性化合物 死时间(min) 保留时间（min） 半高峰宽(min) 分离度Rs V甲醇/V水
尼莫地平 1.688 3.956 6.210 0.586 1.098 1.34 50/50
盐酸克伦特罗 1.385 3.360 6.403 1.709 2.589 0.71 30/70

　　本文在反相色谱条件下，对尼莫地平和盐酸克伦特罗这两种单手性中心药物进行了初步的分离，实验表明，在酸性条件下，尼莫地平和盐酸克伦特罗在2，6-二-O-丙酰基-β-CD色谱柱上得到了较好的分离。

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Synthesis and Enantioseparation Properties of a Novel Chiral Stationary Phase Derived from 2, 6-di-O-Propionyl -β-Cyclodextrin Bonded Silica Stationary Phase

Ma Ning , Luo Ai-qin,* Yang shao-ning, Ding Guang-hui, Ning zhou-Yun
(.School of Life Science and Technology, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China)

Abstract In this work, a novel chiral stationary phase was prepared. 2, 6-di-O-propionyl -β-cyclodextrin bonded silica stationary phase was prepared and separately characterized by Molisch color reaction, XPS and IR. The enaptioseparation capability of prepared chiral stationary phase was evaluated by high performance liquid chromatography. The results showed that it could separate chiral drugs in reverse phase model.
Key words Chiral Stationary Phase; HPLC; 2, 6-di-O- Propionyl -β-Cyclodextrin; Bonded Silica